章瀾 黃從新

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北重點實驗室，湖北 武漢 430060)

現(xiàn)如今缺血性損傷所致的心血管疾病仍是全球死亡的主要原因[1]。數(shù)百萬的心肌細(xì)胞因心肌梗死而丟失，再生醫(yī)學(xué)最重要的挑戰(zhàn)之一是設(shè)計如何替換心肌梗死后失去的數(shù)百萬心肌細(xì)胞，從而迅速觸發(fā)先天免疫反應(yīng)以清除死亡或垂死的細(xì)胞，并且激活產(chǎn)生膠原的成肌纖維細(xì)胞以重塑細(xì)胞外環(huán)境[2]。在過去的20年里，研究人員已確定了幾種心臟修復(fù)的潛在策略，如誘導(dǎo)現(xiàn)有心肌細(xì)胞的增殖，通過注射干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療[3-5]。然而，由于成年哺乳動物的心肌細(xì)胞不會重新進(jìn)入細(xì)胞周期來替代缺血組織，因此心肌的損傷是不可逆的[3]，目前還無針對人類心臟病的有臨床意義的再生療法。心外膜是位于心臟表面的一層由間皮細(xì)胞組成的膜，是一種多功能的心臟祖細(xì)胞組織，是心臟發(fā)育的信號中心，在心臟發(fā)育過程中起著重要的作用。在近期斑馬魚和小鼠的研究中表明，心臟損傷使心外膜及其衍生物復(fù)活，從而調(diào)節(jié)組織修復(fù)[6]。過去10年的研究表明，心外膜可能是心臟修復(fù)策略的關(guān)鍵靶點?，F(xiàn)總結(jié)心外膜與心臟修復(fù)和再生的相關(guān)機(jī)制，以及心外膜對心臟形成和發(fā)育的功能性貢獻(xiàn)，并提出未來的觀點，以突出新興的治療策略，旨在利用心外膜的再生潛力進(jìn)行心臟修復(fù)。

1 心臟再生模型

受損心臟的功能再生預(yù)計包括清除壞死組織，恢復(fù)失去的肌肉，重建血管，以及消除新心肌細(xì)胞的電偶聯(lián)、炎癥和膠原蛋白、纖維蛋白的積累，其中主要的終點是產(chǎn)生新的、健康的心肌細(xì)胞[7-8]。雖然在成年哺乳動物心臟中有低水平心肌細(xì)胞增殖的報道，但表面上很少發(fā)生這種自然事件對心臟修復(fù)有意義的影響[9]。在2011年，Porrello等[10]研究的結(jié)果首次證明，新生小鼠在出生后的最初幾天，可在切除損傷后產(chǎn)生大量的再生反應(yīng)，從而產(chǎn)生具有有限瘢痕的全尺寸心室。遺傳命運(yùn)圖譜顯示，這種修復(fù)是由現(xiàn)有心肌細(xì)胞的增殖介導(dǎo)的。在低溫?fù)p傷模型中，將冷卻的探針應(yīng)用于1日齡小鼠的心室表面，誘導(dǎo)局部細(xì)胞死亡，心臟在非跨壁損傷后再生，而在跨壁損傷后則不能再生[10]。這說明心臟的再生能力取決于受傷的嚴(yán)重程度。小鼠在7 d大的時候就失去了心臟再生能力，之后就會留下瘢痕。小鼠心臟再生能力與心肌細(xì)胞增殖之間的緊密聯(lián)系可能不僅僅是巧合[11-12]。此外，在出生早期，大多數(shù)小鼠心肌細(xì)胞是二倍體，過去兩年的研究表明，心肌細(xì)胞多倍體與心臟的損傷性再生能力有關(guān)[13]。與哺乳動物相反，低等脊椎動物例如斑馬魚和某些兩棲動物，成年后具有增強(qiáng)受傷心肌再生的能力。在這些較低的脊椎動物模型系統(tǒng)中，斑馬魚由于心肌替代的一致性和廣泛性以及該模型系統(tǒng)在分子遺傳學(xué)上的優(yōu)勢，成為研究最為廣泛的模型系統(tǒng)[14]。

2 心外膜在心臟再生中的作用

2.1 心肌損傷后心外膜細(xì)胞起到激活心肌的作用

在過去的十年中，越來越多的研究通過動物模型系統(tǒng)來確定心外膜組織影響心臟修復(fù)的機(jī)制。低等脊椎動物如斑馬魚和某些有尾目兩棲動物，成年后擁有強(qiáng)大的心臟再生能力，其中斑馬魚由于其分子遺傳學(xué)的優(yōu)勢而備受研究人員關(guān)注[14]。在正常情況下，成體心外膜處于相對靜默狀態(tài)。當(dāng)心臟受到損傷時，心外膜對這種損傷具有快速而強(qiáng)烈的反應(yīng)。心臟損傷后，心外膜細(xì)胞誘導(dǎo)標(biāo)記胚胎心外膜，增殖并覆蓋損傷部位的基因表達(dá)，這一過程稱為激活。在斑馬魚中，實際上整個心外膜在受傷后的1～2 d內(nèi)被激活，表達(dá)如抗衰蛋白，視黃醛脫氫酶(retinaldehyde dehydrogenase，RALDH)2，Tbx18蛋白和腎母細(xì)胞瘤1(Wilms tumor-1，Wt1)蛋白等蛋白[15]。在新生小鼠中，根尖切除與快速心外膜激活類似，都在整個器官范圍內(nèi)誘導(dǎo)RALDH2和Wt1表達(dá)。在成年小鼠中，心臟損傷還引起胚胎心外膜標(biāo)志物的重新表達(dá)[16]。

心臟損傷激活心外膜的分子機(jī)制(尤其是在器官范圍內(nèi))讓很多科學(xué)家非常感興趣，但對其仍知之甚少。有學(xué)者試圖通過評估標(biāo)記小鼠胚胎心外膜的基因附近潛在的DNA調(diào)控元件的保守性來解決這個問題。研究人員通過與這些基因附近的增強(qiáng)子結(jié)合，確定了CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族是胚胎心臟和心肌梗死后成年心臟中RALDH2和Wt1表達(dá)的調(diào)節(jié)因子[17]。一項2017年的研究確定了轉(zhuǎn)錄激活因子BRG1(SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體的催化亞基)在小鼠心臟發(fā)育過程中和心臟損傷后具有心外膜表達(dá)，是Wt1表達(dá)和心外膜激活的調(diào)節(jié)劑[18]。也有研究表明，心外膜激活會加劇炎癥反應(yīng)。小鼠缺血再灌注損傷后，在心外膜表面、心外膜下腔和梗死區(qū)域可觀察到中性粒細(xì)胞。在成人心外膜中，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白顯性陰性突變體的病毒表達(dá)減少了中性粒細(xì)胞的數(shù)量，表明CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子在中性粒細(xì)胞浸潤中具有調(diào)節(jié)功能。此外，心外膜與巨噬細(xì)胞的緊密連接表明與心外膜細(xì)胞活化有關(guān)。對心外膜細(xì)胞內(nèi)在程序的研究和對激活外膜的外在因素的鑒定將有助于衍生生物學(xué)和潛在治療策略上的新發(fā)現(xiàn)[19]。

2.2 心肌損傷后心外膜細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞參與心肌再生

早在對斑馬魚心尖切除再生機(jī)制研究中[19]，研究者發(fā)現(xiàn)心尖切除后會啟動心外膜細(xì)胞經(jīng)過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)向心內(nèi)膜下遷徙分化為心肌細(xì)胞，參與心肌再生。2007年Smart等[20]發(fā)現(xiàn)使用胸脈肽β4預(yù)處理成年小鼠，能誘導(dǎo)心外膜細(xì)胞重新再表達(dá)Wt1，其用胸脈肽β4預(yù)處理的小鼠再構(gòu)建心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)心肌梗死2 d后轉(zhuǎn)基因黃色熒光特異性標(biāo)志的Wt1細(xì)胞(YFP+/Wt1+)位于成年小鼠心外膜上，并且可分化為Nkx2.5+和Isl1+心肌祖細(xì)胞，該研究首次指出，成年哺乳動物心肌損傷后心外膜能分化為心肌細(xì)胞參與再生，但其機(jī)制尚不明確。

盡管如此，對于心肌梗死后Wt1心外膜細(xì)胞是否能分化為心肌細(xì)胞目前尚有爭議。2011年Zhou等[21]在成年小鼠心肌梗死模型上研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后Wt1心外膜細(xì)胞經(jīng)過EMT后生成的心外膜衍生祖細(xì)胞(epicardium derived cells，EPDCs)僅存在心臟表面，僅能分化為成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，不能分化為心肌細(xì)胞。2012年Zhou等[22]建立wTIeR26R轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)心肌梗死后Wt1心外膜細(xì)胞能分化為心肌細(xì)胞，但形狀為小圓，無成熟心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，且數(shù)量少，于心肌梗死1～3個月出現(xiàn)在心肌梗死區(qū)，因此可排除Cre-loxP隨機(jī)重組或細(xì)胞融合的可能。由此可見成年哺乳動物心肌梗死后能激活Wt1在心外膜上再次表達(dá)并向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但與胚胎期不同在于產(chǎn)生的EPDCs缺乏遷徙能力，僅在心肌梗死區(qū)分化為少量的心肌細(xì)胞。Smart等[20]用能促細(xì)胞遷徙的細(xì)胞因子胸腺肽β4預(yù)處理誘導(dǎo)Wt1心外膜細(xì)胞參與再生，可能正是該細(xì)胞因子增強(qiáng)了Wt1心外膜細(xì)胞向心肌遷徒進(jìn)而分化為心肌細(xì)胞的能力。

3 心外膜與心臟再生和修復(fù)的關(guān)聯(lián)

3.1 心外膜源性細(xì)胞在心臟損傷反應(yīng)中的作用

先前存在的心外膜源性心臟成纖維細(xì)胞是肌纖維母細(xì)胞的主要來源，肌纖維母細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)在壓力過載或缺血重塑時產(chǎn)生瘢痕組織。心外膜衍生的周細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞也被報道表現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞特性，并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)以響應(yīng)損傷。成人心外膜被重新激活和擴(kuò)張，以響應(yīng)心臟損傷。一小部分EPDCs經(jīng)歷EMT，成為分泌細(xì)胞外基質(zhì)的肌纖維。在有限的情況下，EPDCs還可成為脂肪細(xì)胞。激活的心外膜還促進(jìn)炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的募集，并通過趨化因子的分泌穩(wěn)定冠狀血管。心外膜也可促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活和/或細(xì)胞生長[23]。

3.2 心外膜再激活

心肌損傷后胎兒心外膜基因的激活被認(rèn)為是一種保守的心臟修復(fù)機(jī)制。Wt1、Tbx18、RALDH1和RALDH2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在小鼠心肌梗死后1 d和5 d內(nèi)上調(diào)，尤其是在瓣膜和心房周圍，在損傷后2～4周表達(dá)減弱[24]。在成年小鼠和犬模型中都有記載，胎兒心外膜基因誘導(dǎo)與增殖增加和明顯的心外膜增厚相關(guān)[25]。與胎兒心外膜不同，成人心外膜會經(jīng)歷EMT并產(chǎn)生心臟成纖維細(xì)胞和血管壁細(xì)胞，譜系追蹤實驗表明，心外膜對新生成纖維細(xì)胞或側(cè)支形成的貢獻(xiàn)最小。相比之下，認(rèn)為成人心外膜更可用作再生潛能有限的旁分泌信號的來源[26]。因此，一個新興的研究領(lǐng)域包括開發(fā)利用心外膜源性發(fā)展計劃(EpCar撥號衍生的開發(fā)程序)來促進(jìn)成年心臟的修復(fù)和再生的方法正在誕生[10]。

3.3 心外膜調(diào)節(jié)炎癥

急性炎癥是一種清除死亡細(xì)胞組織的代償性反應(yīng)，然而，慢性炎癥可增加細(xì)胞死亡、纖維化形成和心功能不全障礙。最近的報告表明，細(xì)胞和旁分泌的炎癥過程，部分由重新激活的心外膜協(xié)調(diào)[27]。在健康心外膜中可觀察到具有修復(fù)特性的常駐心臟巨噬細(xì)胞(M2巨噬細(xì)胞)，但在衰老相關(guān)心臟功能障礙模型中其明顯耗盡[28]。Wt1b是一種早期的心外膜反應(yīng)基因，與斑馬魚中的再生巨噬細(xì)胞的表達(dá)重疊，提示了在心臟發(fā)育過程中心臟巨噬細(xì)胞募集時心外膜的需求。Hippo信號通路下游作用因子Yes相關(guān)蛋白/含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子在心肌梗死后加重心臟炎癥，這是由于免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的有限募集和來自成年小鼠心外膜的炎性細(xì)胞因子γ干擾素的分泌減少所致。在小鼠缺血再灌注損傷后腺病毒介導(dǎo)的CCAAT/增強(qiáng)蛋白結(jié)合蛋白增強(qiáng)Wt1和RALDH2的激活，推測其是通過減少急性中性粒細(xì)胞浸潤來減弱心臟損傷和纖維化[29]。

3.4 心外膜在心臟再生中的應(yīng)用

心外膜不僅可通過分化為成纖維細(xì)胞、血管壁細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等以促進(jìn)心臟再生，而且可通過分泌成纖維細(xì)胞生長因子等有絲分裂原的混合物來促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和胚胎心臟的生長。心臟再生發(fā)生在斑馬魚和出生后早期哺乳動物心臟的許多刺激中，包括根尖切除術(shù)、新生兒心肌梗死、冷凍消融或靶向消融。心外膜通過領(lǐng)導(dǎo)雙核心外膜細(xì)胞的遷移而主動再生，創(chuàng)口閉合，并有助于血管周細(xì)胞(平滑肌和成纖維細(xì)胞)的形成。心外膜源性成纖維細(xì)胞已獲得肌成纖維細(xì)胞表型(肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì))，這在瘢痕消退階段可能是可逆的。心外膜通過分泌有絲分裂原促進(jìn)巨噬細(xì)胞募集、血管新生以及心肌細(xì)胞周期再入[30]。

目前，通過增強(qiáng)內(nèi)源性心臟修復(fù)祖細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和移植源自骨髓和心臟的細(xì)胞已取得了有限的成功。來源于成年人右心耳組織的原代心外膜細(xì)胞在體外培養(yǎng)早期即自發(fā)經(jīng)歷了EMT轉(zhuǎn)變并獲得成纖維細(xì)胞性質(zhì)，用腺病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子心肌蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1或骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)2導(dǎo)入EPDCs時，這些細(xì)胞可分化為平滑肌細(xì)胞[31]。人類誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)的最新進(jìn)展已證明了通過調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生因子、Wnt/β-Catenin信號通路、成纖維細(xì)胞生長因子和視黃酸信號傳導(dǎo)途徑將多能細(xì)胞分化為心外膜細(xì)胞及其衍生物的可行性。將人胚胎干細(xì)胞源性心外膜細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，可促進(jìn)心臟組織收縮力和心肌細(xì)胞的成熟[32]。此外，將人胚胎干細(xì)胞源性心外膜細(xì)胞和心肌細(xì)胞共同移植到梗死大鼠心臟中，可增強(qiáng)移植效果，同時改善收縮功能，并增加了與心肌細(xì)胞單獨(dú)的血運(yùn)重建，朝著治療實踐邁進(jìn)了一大步[32]。各種心臟疾病模型以評估心外膜激活的最新進(jìn)展表明，通過促進(jìn)心外膜和內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞之間的相互作用，心臟再生得到增強(qiáng)[33-35]。心外膜人卵泡抑素樣蛋白1的丟失是一種對損傷的適應(yīng)性反應(yīng)，恢復(fù)其水平將是逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心肌死亡和重構(gòu)的有效方法[36]。故上游生長因子信號可用于增強(qiáng)體外心外膜細(xì)胞的擴(kuò)增或用于臨床實踐的新型治療策略的產(chǎn)生。然而，若供體不是自體的受體，細(xì)胞移植會受到免疫排斥的阻礙[37]。目前，關(guān)于心外膜細(xì)胞異質(zhì)性的重要問題仍存在，這可能會使利用心外膜進(jìn)行心臟修復(fù)的策略復(fù)雜化。因此，需對心外膜的屬性進(jìn)行全面的分析評估，包括心外膜細(xì)胞的來源與分型、心外膜應(yīng)對不同損傷或環(huán)境的反應(yīng)、心外膜與心肌細(xì)胞間的聯(lián)系、心臟再生中心外膜的變化以及不同種屬之間心外膜行為的異同等以加強(qiáng)對心外膜細(xì)胞對正常發(fā)育、先天性心臟病和心力衰竭貢獻(xiàn)的了解，為利用心外膜的再生潛力進(jìn)行心臟修復(fù)提供新策略。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可能對這個問題提供思路。利用高通量單細(xì)胞RNA測序平臺(RNA-seq或scRNA-seq)對心外膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，可識別出對心臟損傷反應(yīng)起作用的基因和通路。

4 展望

心臟病是人類健康的主要?dú)⑹种?，因而心肌再生和修?fù)具有廣泛且重要的臨床應(yīng)用價值。心外膜在心臟發(fā)育中的重要地位提示其作為潛在治療手段的優(yōu)越性。本文討論了通過心外膜的細(xì)胞自主和非自主功能調(diào)節(jié)心臟生長和組織修復(fù)的基因程序，廣泛地分析描述了心外膜分泌的因素，包括轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的研究，以及炎癥因子的調(diào)制，這可能會加強(qiáng)心外膜介導(dǎo)的心臟修復(fù)。此外，治療策略的發(fā)展，以成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化為代價將EPDCs重新定向到增殖細(xì)胞類型的策略，可補(bǔ)充目前主要基于干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能細(xì)胞遞送的再生醫(yī)學(xué)方法。