呂艷杭，吳姍姍，王振常，葉學(xué)勁，符燕青，段桂姣，蘇曉文，農(nóng)小欣

肝硬化指由一種或多種病因長期、反復(fù)刺激肝臟而造成的肝彌漫性損傷，肝硬化進(jìn)展至一定程度、超出肝臟代償能力時稱之為肝硬化失代償期。肝硬化失代償期主要臨床表現(xiàn)為肝功能減退和門靜脈高壓，發(fā)病率和致死率極高[1]。原位肝移植（OLT）是肝硬化失代償期等終末期肝病的理想治療方法，但由于肝臟供體緊缺、費用高、免疫排斥反應(yīng)高等限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種多功能干細(xì)胞，可在體內(nèi)分化為正常肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，并可通過分泌多種促進(jìn)肝臟生長的因子而逆轉(zhuǎn)肝纖維化或肝硬化進(jìn)程[4-6]。

研究表明，炎性因子在肝硬化發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白介素（IL）-2、IL-10、IL-12等參與肝臟炎癥的發(fā)展，而促炎/抗炎因子失衡可加速肝硬化進(jìn)程[7-9]；Th1/Th2失衡也與肝纖維化、肝硬化有關(guān)[10]，其中Th1類細(xì)胞因子可抑制膠原蛋白合成及肝星狀細(xì)胞增殖，而Th2類細(xì)胞因子可促進(jìn)膠原蛋白合成及肝星狀細(xì)胞增殖并抑制二者降解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積及纖維化[11]；氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中形成的氧自由基可參與肝星狀細(xì)胞由上皮型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型，引起機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，加快肝纖維化進(jìn)展為肝硬化的速度[12]。本研究旨在探討柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)治療肝硬化失代償期的臨床療效及其對血清炎性因子水平、免疫功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病區(qū)及廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病區(qū)2016年5月—2019年5月收治的肝硬化失代償期患者120例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A組、B組和C組，每組40例。A組中男28例，女12例；年齡32～65歲，平均年齡（56.7±5.3）歲；病程6～13年，平均病程（9.2±3.2）年。B組中男26例，女14例；年齡34～68歲，平均年齡（58.4±5.3）歲；病程7～11年，平均病程（9.0±4.2）年。C組中男29例，女11例；年齡35～67歲，平均年齡（58.5±5.6）歲；病程7～12年，平均病程（9.2±3.6）年。三組患者性別（χ2=1.43，P=0.26）、年齡（F=1.26，P=0.35）、病程（F=0.96，P=0.58）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 肝硬化失代償期西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年《慢性乙型肝炎防治指南》[13]：（1）影像學(xué)、實驗室檢查結(jié)果提示肝細(xì)胞合成障礙、門靜脈高壓、脾大及食管-胃底靜脈曲張等；（2）臨床表現(xiàn)為蜘蛛痣、肝掌、腹腔積液、黃疸、男性乳房發(fā)育甚至肝性腦病等。肝硬化失代償期中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中鼓脹、黃疸的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主癥為腹部脹滿、皮膚緊繃，甚至腹大如鼓，扣之有鼓音伴移動性濁音、納差、神疲乏力、脅痛及便溏等[14]。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合肝硬化失代償期的中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌；（2）臨床資料不完整；（3）對造影劑過敏；（4）慢性腎功能不全（血肌酐＞300 μmol/L）；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）嚴(yán)重心血管、肺、腎、腦疾病，內(nèi)分泌、造血系統(tǒng)等疾病，精神疾病。

1.4 剔除與脫落標(biāo)準(zhǔn) 剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)；（2）因臨床資料不完整而影響研究結(jié)果；（3）因研究數(shù)據(jù)不全而不能判斷臨床療效。脫落標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者中途退出研究；（2）不按照規(guī)定進(jìn)行治療；（3）未完成整個臨床試驗。中止試驗是指臨床試驗尚未按預(yù)定方案完成但由于出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥等中止或停止全部試驗。

1.5 治療方法

1.5.1 A組 A組患者采用內(nèi)科綜合治療，具體如下：（1）一般支持治療：臥床休息，減少體力消耗，減輕肝臟負(fù)擔(dān)，高蛋白、低脂肪、適量糖類飲食（進(jìn)食不足者可通過靜脈通路補(bǔ)充熱量及維生素），補(bǔ)充白蛋白或新鮮血漿以糾正低白蛋白血癥，并酌情補(bǔ)充凝血因子，注意糾正水、電解質(zhì)紊亂及消毒隔離，加強(qiáng)口腔護(hù)理，預(yù)防院內(nèi)感染。（2）針對病毒復(fù)制活躍期患者，可考慮給予抗病毒治療；采用乳果糖酸化腸道以減少腸道細(xì)菌異位；采用抗氧化劑還原型谷胱甘肽等進(jìn)行保肝治療；行促進(jìn)肝細(xì)胞生長治療以減少肝細(xì)胞壞死、促進(jìn)肝細(xì)胞再生；行免疫調(diào)節(jié)治療以調(diào)節(jié)肝衰竭患者免疫功能、減少感染等并發(fā)癥的發(fā)生，可酌情使用胸腺素α1等免疫調(diào)節(jié)劑。（3）防治肝性腦病、腦細(xì)胞水腫、肝腎綜合征等并發(fā)癥。經(jīng)內(nèi)科綜合治療無效者需盡早考慮人工肝支持治療甚至肝臟移植。

1.5.2 B組 B組患者在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上進(jìn)行1次BMSCs移植術(shù)，術(shù)后給予抗病毒治療1年。BMSCs移植方案：（1）移植前骨髓動員：動員劑為重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（商品名：欣粒生，廈門特寶生物工程股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S19990040），劑量為150 mg/次，使用頻率為1次/d，療程為5 d。注意每次使用動員劑前常規(guī)復(fù)查血常規(guī)和凝血功能，白細(xì)胞計數(shù)≤20×109/L且凝血功能無明顯異常者繼續(xù)使用；白細(xì)胞計數(shù)＞20×109/L或凝血功能明顯異常者則暫停使用，隔日復(fù)查后根據(jù)情況繼續(xù)應(yīng)用動員劑。（2）BMSCs的制備：在百級潔凈手術(shù)室環(huán)境下，嚴(yán)格按照外科無菌操作要求對患者進(jìn)行局部麻醉、消毒，之后通過穿刺患者髂骨抽取抗凝骨髓血約200 ml，采用細(xì)胞分離試劑盒（寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：160920）、負(fù)收集混合法分離BMSCs，并抽取適量標(biāo)本送檢驗科進(jìn)行合格性檢驗；最后采用0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度并在37 ℃恒溫條件下保存于無菌瓶內(nèi)，4 h內(nèi)行BMSCs移植術(shù)。（3）BMSCs的鑒定：采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原并進(jìn)行鑒別，以從成人骨髓中分離培養(yǎng)的BMSCs穩(wěn)定表達(dá)CD73、CD105、CD166而不表達(dá)CD34、CD45為合格BMSCs。（4）BMSCs移植術(shù)主要操作步驟：術(shù)前常規(guī)備皮、禁食6 h，在數(shù)字減影血管造影（DSA）引導(dǎo)、局部麻醉下采用Seldinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動脈并置入5 F動脈鞘，引入5 F RH肝動脈導(dǎo)管并置于肝固有動脈；結(jié)合DSA顯示的血管分布情況在肝內(nèi)局部緩慢注入分離好的BMSCs懸液，注入完畢后拔出動脈鞘，加壓包扎穿刺部位，囑患者臥床休息24 h并進(jìn)行常規(guī)對癥處理。

本研究背景:

肝硬化是嚴(yán)重危害人們健康的重大疾病之一，而其治療仍是目前醫(yī)學(xué)界難題之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植術(shù)為肝硬化患者帶來了希望，但BMSCs在骨髓中含量極少且歸巢能力有限，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案可促進(jìn)BMSCs歸巢肝臟，對充分發(fā)揮中醫(yī)藥維持或改善機(jī)體正常再生修復(fù)作用具有重要意義。

本研究創(chuàng)新點:

國際上對干細(xì)胞的研究多著眼于移植和克隆，而通過藥物激活內(nèi)源性干細(xì)胞從而改善再生反應(yīng)與從外部植入干細(xì)胞是全然不同的新思路。在移植干細(xì)胞數(shù)量不足以恢復(fù)肝功能且內(nèi)源性干細(xì)胞自身遭破壞、修復(fù)能力有限的情況下，采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案雖不能替代干細(xì)胞移植，但可以促進(jìn)BMSCs、體內(nèi)干細(xì)胞歸巢肝臟并分化為肝細(xì)胞，從而使殘留肝細(xì)胞群擴(kuò)展至足夠數(shù)量并提高其質(zhì)量。

本研究價值:

本研究采用先進(jìn)的實驗研究技術(shù)系統(tǒng)地從促BMSCs修復(fù)受損肝臟、促進(jìn)肝功能恢復(fù)、改善機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)炎性因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面探討了中醫(yī)藥聯(lián)合 BMSCs移植術(shù)對肝硬化失代償期的協(xié)同增效作用，并用現(xiàn)代化語言闡釋了名老中醫(yī)學(xué)術(shù)理論，同時重視利用中醫(yī)藥調(diào)控機(jī)體再生修復(fù)機(jī)制以減少或防止機(jī)體再生病變、減少對移植干細(xì)胞數(shù)量的需求及培養(yǎng)擴(kuò)增等繁瑣操作，為干細(xì)胞動員提供了新的思路。

1.5.3 C組 C組患者在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上采用柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)，即在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上進(jìn)行1次BMSCs移植術(shù)，術(shù)后長期抗病毒治療同時給予柔肝化纖顆粒治療。柔肝化纖顆粒由黃芪45 g、牡蠣30 g、黃精20 g、枸杞20 g、薏苡仁45 g、橘紅10 g、澤蘭30 g、雞內(nèi)金15 g、鱉甲30 g、虎杖20 g、丹皮12 g、黑棗15 g組成，中藥材購自江蘇天陰天江藥業(yè)有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部嚴(yán)格按照1 g：6 g比例進(jìn)行顆粒配方；服用方法：藥品制成顆粒后裝袋（49 g/袋），溫開水沖服，1袋/次，早、中、晚各1次，合1劑/d；療程為1年。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 臨床療效 比較三組患者臨床療效。臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)：治療后患者臨床癥狀明顯改善，體征消失或明顯減輕，肝功能指標(biāo)和凝血酶原時間（PT）均恢復(fù)正常為顯效；治療后患者臨床癥狀和體征好轉(zhuǎn)或無明顯改善，肝功能指標(biāo)和PT較治療前下降＞50%為有效；治療后患者臨床癥狀和體征無明顯改善或出現(xiàn)加重，肝功能指標(biāo)和PT較治療前下降≤50%或病情出現(xiàn)惡化為無效。

1.6.2 主要中醫(yī)證候評分 比較三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分，包括脅痛、納差、神疲乏力、黃疸，分別按照無、輕、中、重計 0、1、2、3 分[14]。

1.6.3 肝功能指標(biāo)及PT 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，采用低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)，TD4）以3 000 r/min的速率在室溫條件下離心10 min，離心半徑為30 cm；取上清液，采用Olympus-Au640型全自動生化儀檢測肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBiL）；采用STAGO血凝儀檢測PT。

1.6.4 血清炎性因子水平 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELLSA）檢測TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平，試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司（生產(chǎn)批號分別為20170721、20171113、20180408、20181006）。

1.6.5 體液及細(xì)胞免疫功能指標(biāo) 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，采用免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白E（IgE）水平，試劑盒購自艾森生物杭州有限公司（生產(chǎn)批號分別為181121、181009、180206、170820）；采用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值。

1.6.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo) 分別于治療前后采集三組患者清晨空腹外周靜脈血5 ml并置于抗凝管，如上離心后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求、采用ELLSA測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司（生產(chǎn)批號分別為20170918、20181206、20170324）。

1.6.7 不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況 記錄患者三組患者治療期間不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料分析采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 治療期間A組2例患者脫落，B組1例患者脫落，最終A組、B組分別納入38、39例患者。三組患者臨床療效比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=11.59，P=0.021）；C組患者臨床療效優(yōu)于A組（u=11.43，P=0.003）、B組（u=4.92，P=0.045），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。

2.2 主要中醫(yī)證候評分 三組患者治療前脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分低于A組、B組，B組患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 三組患者臨床療效比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of clinical responses in the three groups

2.3 肝功能指標(biāo)及PT 三組患者治療前血清ALT、AST、TBiL水平及PT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平及PT比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平低于A組、B組，PT短于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清ALT、AST、TBiL水平低于A組，PT短于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 血清炎性因子水平 三組治療前血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-12水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組、B組，血清IFN-γ、IL-10水平高于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組，血清IFN-γ、IL-10水平高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

2.5 體液及細(xì)胞免疫指標(biāo) 三組患者治療前血清IgA、IgM、IgG、IgE水平和CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清IgA、IgM、IgG、IgE水平和CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組、B組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。

2.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo) 三組患者治療前血清SOD、MDA、GSH-Px水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組患者治療后血清SOD、MDA、GSH-Px水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組、B組，血清MDA水平低于A組、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組，血清MDA水平低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表6）。

表2 三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of mean scores of major TCM syndromes in the three groups before and after treatment

表2 三組患者治療前后主要中醫(yī)證候評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of mean scores of major TCM syndromes in the three groups before and after treatment

注：與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) 脅痛 納差 神疲乏力 黃疸治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 2.3±0.2 1.4±0.1a 2.2±0.1 1.3±0.2a 2.0±0.2 1.1±0.1a 2.4±0.2 1.3±0.2a B 組 39 2.3±0.1 0.9±0.1ab 2.2±0.1 0.9±0.1ab 2.0±0.1 0.8±0.1ab 2.3±0.2 0.9±0.1ab C 組 40 2.3±0.2 0.5±0.1abc 2.1±0.1 0.5±0.1abc 2.0±0.2 0.5±0.1abc 2.4±0.2 0.5±0.1abc F值 1.50 29.30 1.00 58.30 0.51 31.40 0.40 46.20 P值 0.20 ＜0.01 0.40 ＜0.01 0.95 ＜0.01 0.68 ＜0.01

表3 三組患者治療前后肝功能指標(biāo)及PT比較（±s）Table 3 Comparison of mean levels of liver function markers and prothrombin time in the three groups before and after treatment

表3 三組患者治療前后肝功能指標(biāo)及PT比較（±s）Table 3 Comparison of mean levels of liver function markers and prothrombin time in the three groups before and after treatment

注：ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TBiL=總膽紅素，PT=凝血酶原時間；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBiL（μmol/L） PT（s）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 153±12 101±7 a 166±8 98±6a 82.1±4.0 71.5±3.1a 18.6±0.5 16.8±0.4a B 組 39 152±11 79±4ab 165±10 80±5ab 81.9±3.9 59.2±4.7ab 18.6±0.4 15.2±0.4ab C 組 40 153±11 58±5abc 165±9 54±7abc 82.5±4.2 43.7±4.4abc 18.6±0.6 13.3±0.6abc F值 0.10 68.20 0.20 53.80 0.20 44.50 0.10 52.40 P值 0.90 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.80 ＜0.01 0.90 ＜0.01

表4 三組患者治療前后血清炎性因子水平比較（±s）Table 4 Comparison of mean levels of serum inflammatory cytokines in the three groups before and after treatment

表4 三組患者治療前后血清炎性因子水平比較（±s）Table 4 Comparison of mean levels of serum inflammatory cytokines in the three groups before and after treatment

注：TNF-α=腫瘤壞死因子，INF-γ=干擾素γ，IL=白介素；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α（ng/L） IFN-γ（ng/L） IL-2（μg/L） IL-10（μg/L） IL-12（ng/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 66.55±3.76 54.42±2.66a 42.76±3.98 50.63±2.47a 66.54±2.85 57.16±2.31a 22.32±2.34 31.61±1.99a 73.21±3.89 60.47±4.45a B 組 39 67.72±3.86 49.03±2.21ab 43.26±3.69 58.26±3.38ab 66.51±2.42 48.92±3.26ab 22.38±1.50 38.46±2.26ab 72.97±3.62 55.26±5.48ab C 組 40 67.11±3.91 40.90±3.18abc 42.87±3.61 62.82±3.26abc 66.00±2.81 35.28±3.01abc 22.28±2.18 43.54±3.75abc 72.79±4.01 41.62±4.21abc F值 0.92 46.43 0.23 57.96 0.76 74.70 0.22 45.71 0.27 58.63 P值 0.40 ＜0.01 0.80 ＜0.01 0.47 ＜0.01 0.98 ＜0.01 0.93 ＜0.01

表5 三組患者治療前后體液及細(xì)胞免疫指標(biāo)比較（±s）Table 5 Comparison of mean levels of humoral and cellular immune markers in the three groups before and after treatment

表5 三組患者治療前后體液及細(xì)胞免疫指標(biāo)比較（±s）Table 5 Comparison of mean levels of humoral and cellular immune markers in the three groups before and after treatment

注：IgA=免疫球蛋白A，IgM=免疫球蛋白M，IgG=免疫球蛋白G，IgE=免疫球蛋白E；與治療前比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) IgA（g/L） IgM（mg/L） IgG（g/L） IgE（mg/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 0.66±0.07 0.90±0.08a 5.09±0.15 5.51±0.46a 3.83±0.21 3.55±0.42a 1.24±0.70 0.88±0.08a B 組 39 0.65±0.09 1.16±0.12ab 5.08±0.18 5.97±0.39ab 3.80±0.22 3.00±0.21ab 1.25±0.66 0.72±0.06ab C 組 40 0.65±0.06 1.43±0.07abc 5.11±0.21 6.73±0.35abc 3.81±0.23 2.38±0.25abc 1.24±0.71 0.58±0.05abc F值 0.16 17.47 0.32 91.01 0.21 40.17 0.23 16.49 P值 0.85 ＜0.01 0.72 ＜0.01 0.81 ＜0.01 0.79 ＜0.01組別 CD3+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%） CD4+細(xì)胞比值治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后+/CD8 A 組 55.38±5.72 60.47±3.88a 30.05±2.01 32.95±5.14a 37.08±1.51 32.55±1.62a 0.81±0.07 1.01±0.16ab B 組 56.28±4.89 63.27±4.26ab 30.00±2.00 37.64±5.61ab 36.77±1.18 29.56±1.50ab 0.82±0.06 1.27±0.07ab C 組 55.63±4.93 69.48±4.78abc 30.31±1.85 43.23±4.18abc 36.82±1.92 25.51±1.67abc 0.84±0.06 1.70±0.14abc F值 1.53 26.54 0.36 96.78 1.85 20.00 1.98 61.89 P值 0.11 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.08 ＜0.01 0.14 ＜0.01

2.7 不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥發(fā)生情況 A組患者治療期間出現(xiàn)腹腔積液3例、消化道出血1例；B組患者治療期間出現(xiàn)肝性腦病1例、腹腔積液1例；C組患者治療期間無一例出現(xiàn)不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥。

3 討論

肝硬化是多種慢性肝病的終末期表現(xiàn)，在中國肝硬化主要由乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）持續(xù)感染引起；據(jù)統(tǒng)計，我國平均HBV陽性率為7.18%，平均HCV陽性率為3.2%[15]。隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣改變，我國由于飲酒過量、肥胖、糖尿病發(fā)病率升高而引起的酒精性和非酒精性肝病患者數(shù)量逐年增多，而酒精性和非酒精性肝病均有很大可能或已發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化，因此肝纖維化或肝硬化患者數(shù)量巨大[16]。

目前，針對肝硬化患者的臨床治療主要集于去除潛在病因、延緩病程進(jìn)展及維持患者生命，其中OLT雖能在一定程度上改善肝硬化患者肝功能并緩解病情，但并不能從根本上解決肝硬化過程中肝細(xì)胞的減少問題，且存在供體資源少、高免疫排斥反應(yīng)、高費用等缺陷。近年研究表明，BMSCs對肝纖維化、肝硬化均有一定治療作用，并可改善患者肝功能，提高患者生存質(zhì)量，同時BMSCs會在受損的肝臟內(nèi)分化為正常肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞并分泌促進(jìn)肝生長的生長因子，進(jìn)而達(dá)到緩解或逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化的目的[17-18]。已有大量研究證實干細(xì)胞治療肝纖維化或肝硬化的分子作用機(jī)制與干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及對微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而BMSCs可在趨化受體作用下遷移至受損的肝臟，進(jìn)而分化為肝細(xì)胞并補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量[19]。此外，QIAO等[20]還發(fā)現(xiàn)，BMSCs可分泌一些促進(jìn)細(xì)胞生長的因子、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物、調(diào)節(jié)IFN-γ和TNF-α而抑制肝星狀細(xì)胞增殖。但是，BMSCs在骨髓中含量極少且其向肝臟損傷部位歸巢能力有限，因此BMSCs在臨床上的應(yīng)用也受到一定限制，而通過為干細(xì)胞的自我更新與定向分化提供一個良好的微環(huán)境以使其在含量極少的情況上提高存活率、增殖率并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞是目前肝硬化失代償期治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

中醫(yī)學(xué)無肝硬化的病名，根據(jù)臨床癥狀及體征可將其歸于“臌脹”“黃疸”“積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，肝硬化的主要病機(jī)為毒、瘀、虛羈留搏結(jié)，濕、熱、瘀、毒侵犯肝臟導(dǎo)致肝脾不調(diào)、氣虛血瘀，日久正氣虧虛而造成肝絡(luò)受損；而“腎藏精”，主生長發(fā)育與生殖，這與干細(xì)胞的“自我更新”和“定向分化”有很大的相似性和相關(guān)性。許靜等[21]研究證實，補(bǔ)腎中藥淫羊藿可通過動員體內(nèi)激素、細(xì)胞因子而激活內(nèi)源性干細(xì)胞。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎藏精，肝藏血，腎中精氣充盈則肝有所養(yǎng)，血有所充；肝藏血量充盈則腎有所藏，精有所資，故云“肝腎同源、精血同源、相互化生”。吳理茂等[22]等研究發(fā)現(xiàn)，歸元方與BMSCs移植術(shù)對急、慢性肝損傷有明確的治療作用，二者聯(lián)用可優(yōu)勢互補(bǔ)，具有協(xié)同增效作用。范慧慧等[23]研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀方藥不僅能激活并促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞大量增殖，還能調(diào)控內(nèi)源性干細(xì)胞分化。

柔肝化纖顆粒由全國名老中醫(yī)林沛湘所創(chuàng)壯肝逐瘀煎與關(guān)幼波教授治療肝炎肝硬化有效經(jīng)驗方組合而成，并由黃芪、牡蠣、黃精、枸杞、薏苡仁、橘紅、澤蘭、雞內(nèi)金、鱉甲、虎杖、丹皮、黑棗組成，具有健脾補(bǔ)腎柔肝兼顧解毒活血、化痰軟堅散結(jié)功效和明顯的保肝、抗纖維化、抗肝硬化作用。柔肝化纖顆粒中黃芪、黃精、枸杞子、薏苡仁、黑棗具有益氣健脾、補(bǔ)腎柔肝功效，有利于通過恢復(fù)機(jī)體正氣、補(bǔ)腎生髓成肝而恢復(fù)肝臟組織氣血津液，進(jìn)而保障歸巢干細(xì)胞增殖、分化、修復(fù)、再生；橘紅、澤蘭、鱉甲、生牡蠣具有活血祛瘀、化痰散結(jié)功效，可通過活血化痰而調(diào)整氣血關(guān)系、達(dá)到“血和則經(jīng)脈流行”的目的，進(jìn)而為干細(xì)胞在肝臟的順利歸巢提供有利條件。本研究結(jié)果顯示，C組患者臨床療效優(yōu)于A組和B組，且患者治療后脅痛、納差、神疲乏力、黃疸評分及血清ALT、AST、TBiL水平低于A組、B組，PT短于A組、B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者臨床癥狀和體征、肝功能和凝血功能，有利于為受損的肝細(xì)胞創(chuàng)造再生及功能恢復(fù)的內(nèi)環(huán)境，促使干細(xì)胞在肝臟歸巢、分化。

研究表明，HBV等病毒持續(xù)感染過程中炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答紊亂會引起慢性肝損傷及肝纖維化，而促炎/抗炎因子及Th1/Th2的動態(tài)平衡在肝纖維化、肝硬化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[24-25]。IL-2、IL-10、IL-12均為白介素家族成員，其中IL-2、IL-12是促炎性因子，可加劇肝纖維化進(jìn)程[26]；IL-10是一種抗炎因子，可通過促進(jìn)T輔助細(xì)胞增殖而抑制促炎性因子的過度表達(dá)并減輕炎性反應(yīng)所致肝損傷[27]。TNF-α與IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，其中TNF-α可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎性因子并參與炎性反應(yīng)及抗凋亡等過程；IFN-γ主要參與抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)[28]。由Th2細(xì)胞分泌的IL-10的主要作用為誘發(fā)過敏反應(yīng)[29]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清TNF-α、IL-2、IL-12水平低于A組和B組，而血清IFN-γ、IL-10水平高于A組和B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效減輕肝硬化失代償期患者炎性反應(yīng)，對促炎/抗炎因子及Th1/Th2失衡具有一定調(diào)節(jié)作用。

表6 三組患者治療前后氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較（±s）Table 6 Comparison of mean levels of oxidative stress markers in the three groups before and after treatment

表6 三組患者治療前后氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較（±s）Table 6 Comparison of mean levels of oxidative stress markers in the three groups before and after treatment

注：SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶；與治療前相比aP＜0.05；與A組相比bP＜0.05；與B組相比cP＜0.05

組別 例數(shù) SOD（U/ml） MDA（mol/L） GSH-Px（U/L）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 38 87.39±7.31 94.87±5.74a 15.29±3.08 9.47±1.43a 43.18±4.93 63.37±7.68a B 組 39 86.90±6.99 105.44±4.40ab 15.33±3.23 7.54±1.07ab 43.28±5.07 77.92±5.10ab C 組 40 87.21±5.79 120.62±6.69abc 15.28±3.08 4.97±1.09abc 43.44±5.18 96.54±5.36abc F值 0.10 50.69 0.14 39.03 0.12 79.84 P值 0.93 ＜0.01 0.96 ＜0.01 0.98 ＜0.01

免疫功能主要反映的是機(jī)體對外邪侵襲的抵抗能力，體液及細(xì)胞免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，而免疫功能紊亂是導(dǎo)致肝硬化加重的重要原因，其中外周血T淋巴細(xì)胞亞群在肝臟炎癥、損傷及纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，而免疫球蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞毒作用[30]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清IgA、IgM水平和CD3+、CD4+細(xì)胞分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比值高于A組、B組，血清IgG、IgE水平和CD8+細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于A組、B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者免疫功能。

氧化應(yīng)激反應(yīng)指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）過度產(chǎn)生和/或抗氧化防御功能減弱導(dǎo)致二者平衡受到嚴(yán)重破壞而造成組織、細(xì)胞損傷的狀態(tài)[31]。研究表明，ROS的過度產(chǎn)生可引起生物膜磷脂中多價不飽和酸和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而MDA為脂質(zhì)過氧化物之一，可反映機(jī)體組織損傷程度；SOD和GSH-Px均是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，對調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡具有重要的作用[32]。本研究結(jié)果顯示，C組患者治療后血清SOD、GSH-Px水平高于A組和B組，而血清MDA水平低于A組和B組，表明柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效減輕肝硬化失代償期患者氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示，C組患者治療期間無一例出現(xiàn)不良反應(yīng)和/或并發(fā)癥，提示柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)有利于減少肝硬化失代償期患者治療過程中不良反應(yīng)和或并發(fā)癥的發(fā)生，但由于本研究為單中心研究，樣本量較小、觀察時間較短且A、B組患者中出現(xiàn)并發(fā)癥者例數(shù)過少，無法行統(tǒng)計學(xué)分析及假設(shè)檢驗，因此柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)治療肝硬化失代償期的具體作用機(jī)制及安全性等仍有待進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSCs移植術(shù)可有效改善肝硬化失代償期患者臨床癥狀和體征、肝功能、凝血功能及免疫功能，減輕患者炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，有一定臨床推廣應(yīng)用價值，而采用中醫(yī)藥招募內(nèi)源性干細(xì)胞的動員方案仍需進(jìn)行更多臨床試驗以獲得更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)等。

作者貢獻(xiàn):呂艷杭負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、文章撰寫及論文修訂；吳姍姍進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；王振常負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計及可行性分析，對文章整體負(fù)責(zé)；葉學(xué)勁負(fù)責(zé)文章的監(jiān)督管理；符燕青、段桂姣、蘇曉文、農(nóng)小欣進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計學(xué)處理。

本文無利益沖突。