楊露露 柳云恩 陳穎欣

在軍事行動中，眼外傷是僅次于截肢、創(chuàng)傷性腦損傷和創(chuàng)傷后應激障礙的第四位常見的損傷[1]。爆炸物導致的眼外傷也較為常見，這不僅危害公共健康，更會增加社會的經(jīng)濟成本[2]。研究發(fā)現(xiàn)，眼爆震傷的致盲及眼球摘除率均高于其他眼外傷[3-4]。由于爆震主要損傷眼后節(jié)，因此眼爆震傷的研究多集中于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路是常見的信號轉(zhuǎn)導途徑，已被證實與糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜氧化應激性損傷的病理生理改變有關(guān)[5-7]，但其在早期小鼠視網(wǎng)膜爆震傷中的作用尚未完全清楚。本研究探討Nrf2/HO-1信號通路介導的氧化應激反應對早期小鼠視網(wǎng)膜爆震傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組取雄性C57BL/6小鼠60只(遼寧長生生物技術(shù)有限公司)，6～8周齡，體重20～22 g，適應性飼養(yǎng)1周。將小鼠隨機分為對照組和模型組，對照組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，模型組小鼠接受爆震沖擊處理。去除建模過程中5只死亡小鼠，最終納入對照組16只小鼠、6 h模型組19只小鼠、48 h模型組20只小鼠。

1.1.2 主要試劑和儀器蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)，ECL顯色試劑盒、酶標儀(美國BIO-RAD公司)，Nrf2、HO-1、超氧化物歧化酶(SOD) 2、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素(IL)-10抗體(英國Abcam公司)，黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)抗體(美國CST公司)，免疫組織化學染色試劑盒、檸檬酸組織抗原修復液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DP80光學顯微鏡及攝像裝置(日本Olympus公司)，TP1020脫水機(德國Leica公司)，TD4A離心機(長沙英泰儀器公司)，ZH-3石蠟切片用冷臺(沈陽縱橫高技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠視網(wǎng)膜爆震傷模型的制備參考文獻[8-9]中所述的方法建立小鼠視網(wǎng)膜爆震傷模型。爆震裝置由空氣壓縮、固定、保護裝置及壓力表組成，中間層螺絲固定8層厚約0.8 mm的鋁膜。按照1.5 mL·kg-1體重標準腹腔注射200 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉后將其仰臥位放置于鋁膜上方保護罩內(nèi)，暴露頭部，套網(wǎng)固定。利用壓縮裝置壓縮空氣，增加氣壓，空氣壓縮至臨界點時沖破鋁膜，產(chǎn)生的沖擊波使小鼠視網(wǎng)膜發(fā)生爆震傷。沖擊波產(chǎn)生的壓力0.10～0.14 MPa。分別于建模后6 h、48 h腹腔注射200 g·L-1戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，解剖取材。

1.2.2 HE染色、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度測量摘除完整眼球后將其放入改良FAA固定液浸泡30～60 min，待眼球表面完全變硬，于角鞏膜緣對稱位置開孔并再次浸泡24 h[10]。常規(guī)脫水包蠟，經(jīng)矢狀軸切片，厚約4 μm，貼敷于載玻片上，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，行HE染色。封片后在顯微鏡下觀察小鼠視網(wǎng)膜組織病理學改變情況，進行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)計數(shù)及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)厚度測量。RGC計數(shù)：每組小鼠選取不同標本切片3張，每張切片隨機選取6個視野，計數(shù)每200 μm內(nèi)RGC數(shù)，取其平均數(shù)。RNFL厚度測量：每組小鼠選取不同標本切片3張，用ImageJ軟件測量距鋸齒緣1000 μm處小鼠RNFL厚度，兩側(cè)各測量3次，取其平均數(shù)。

1.2.3 免疫組織化學染色眼球包埋切片方法同上。將組織切片脫蠟水化后，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用檸檬酸于100 ℃高壓鍋中行抗原修復100 s，分別加入Nrf2(1200)、HO-1(1500)、SOD2(1200) 抗體，4 ℃孵育過夜。次日行血清封閉并加入相應二抗，DAB 顯色，蘇木素復染、水化、封片后顯微鏡觀察。每張切片隨機選取6個高倍視野(×400)，用ImageJ軟件計算相應陽性細胞表達率。

1.2.4 Western blot檢測不同因子的蛋白表達摘除小鼠眼球后在顯微鏡下沿角鞏膜緣剪除角膜，取出小鼠晶狀體及玻璃體，將整個視杯翻轉(zhuǎn)剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，剪碎后加入裂解液，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。配平蛋白樣品并加入緩沖液，水浴煮沸致蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉，PBST洗膜3次后加入一抗Nrf2、HO-1、SOD2、iNOS、MDA5及GAPDH(11000)，4 ℃孵育過夜。次日加入相應二抗(12000)，室溫孵育1 h，ECL顯影并拍照。ImageJ軟件分析條帶圖像，計算所檢測蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計學軟件SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)均經(jīng)Levene法檢驗證實方差齊性，再采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果、RGC計數(shù)及RNFL厚度對照組小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整、層次分明，細胞排列緊密均勻，RGC胞體呈圓形且體積較大、胞核邊界清晰。與對照組相比，6 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)疏松，細胞排列紊亂，RGC層、內(nèi)核層及外核層出現(xiàn)核濃縮和空泡現(xiàn)象；RGC數(shù)減少(t=3.32，P<0.05)，RNFL厚度增加(t=4.59，P<0.05)；48 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織細胞排列更為雜亂疏松，RGC數(shù)明顯減少(t=3.91，P<0.05)，RNFL進一步增厚(t=4.12，P<0.05)，并伴有新生血管生成(表1和圖1)。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織RGC計數(shù)和RNFL厚度

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果 A：對照組；B：6 h模型組；C：48 h模型組；D：模型組小鼠視網(wǎng)膜組織新生血管(箭頭所示)生成。

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白、HO-1蛋白、SOD2蛋白表達情況免疫組織化學染色結(jié)果顯示，各組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白表達陽性細胞主要集中于RGC層、內(nèi)核層、外核層(圖2)。與對照組[(7.85±1.16)%]相比，6 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白陽性細胞表達率升高至(16.78±1.38)%；48 h模型組以上指標進一步升高至(20.01±1.48)%，差異均有統(tǒng)計學意義(t=19.18、24.96，均為P<0.05)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白表達免疫組織化學染色結(jié)果 A：對照組；B：6 h模型組；C：48 h模型組；箭頭所示為Nrf2蛋白表達陽性細胞。

各組小鼠視網(wǎng)膜組織HO-1蛋白、SOD2蛋白表達陽性細胞主要集中于RGC層、內(nèi)核層(圖3和圖4)。與對照組[(4.67±0.98)%、(4.15±1.11)%]相比，6 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織HO-1蛋白、SOD2蛋白陽性細胞表達率分別升高至(7.95±1.27)%和(6.14±0.90)%；48 h模型組以上指標繼續(xù)升高，分別為(12.34±1.48)%、(10.25±1.46)%，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。此外，與對照組相比，6 h模型組、48 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織HO-1蛋白、SOD2蛋白表達陽性細胞著色更深，并從視網(wǎng)膜內(nèi)層逐漸向外擴散。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織HO-1蛋白表達免疫組織化學染色結(jié)果 A：對照組；B：6 h模型組；C：48 h模型組；箭頭所示為HO-1蛋白表達陽性細胞。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜組織SOD2蛋白表達免疫組織化學染色結(jié)果 A：對照組；B：6 h模型組；C：48 h模型組；箭頭所示為SOD2蛋白表達陽性細胞。

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Western blot檢測結(jié)果與對照組相比，6 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白、HO-1蛋白、SOD2蛋白、iNOS蛋白、MDA5蛋白相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；48 h模型組以上指標進一步升高，差異亦均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(表2和圖5)。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白、HO-1蛋白、SOD2蛋白、iNOS蛋白、MDA5蛋白相對表達量

圖5 Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜組織不同因子的蛋白表達

3 討論

視網(wǎng)膜是視覺傳導通路的重要一站,易遭受爆震沖擊導致視力障礙。據(jù)調(diào)查，超80%的眼爆震傷患者合并創(chuàng)傷性腦損傷[11]。視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在組織結(jié)構(gòu)上的密切聯(lián)系表明探討視網(wǎng)膜爆震傷機制的必要性。目前，國內(nèi)外對視網(wǎng)膜爆震傷的研究以模擬沖擊波的動物實驗為主[12]，多圍繞病理學改變展開研究，針對分子生物學的研究鮮有報道。視網(wǎng)膜爆震傷的致病機制尚未完全明確，免疫系統(tǒng)激活、活性氧增多、線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性增加等均可導致?lián)p傷發(fā)生[13]。本研究利用空氣壓縮裝置模擬爆炸實況建立視網(wǎng)膜爆震傷動物模型，觀察發(fā)現(xiàn)爆震傷后小鼠視網(wǎng)膜組織疏松、細胞排列紊亂、RGC數(shù)減少、RNFL增厚，這與既往研究[14-15]結(jié)果一致。但我們并未發(fā)現(xiàn)先前研究[16]所述的爆震傷后視網(wǎng)膜內(nèi)層、全層厚度增加及視網(wǎng)膜下出血，這些差異可能是由于爆炸壓力、觀察時間以及爆炸暴露部位、體位的不同所致。

Nrf2是一種氧化還原活性因子，屬于CNC-bZIP家族，由6個功能結(jié)構(gòu)域組成。生理條件下，Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域與其負調(diào)控因子Keap1結(jié)合于細胞質(zhì)，促進Nrf2的泛素化和降解以維持活性氧濃度的動態(tài)平衡；應激時，活性氧促使Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與抗氧化反應元件結(jié)合[17]，通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因活性清除活性氧。其中，HO-1作為Nrf2調(diào)控的下游II相解毒酶，已被發(fā)現(xiàn)參與多種組織器官的內(nèi)源性反應[18-20]，包括抗炎抗氧化、減少線粒體損傷、調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流及細胞凋亡等，是目前氧化應激損傷的研究熱點[21]。

研究發(fā)現(xiàn)，損傷的心肌細胞可通過Nrf2/HO-1軸過表達產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化碳，刺激SOD2表達上調(diào),同時促進生物合成及抗氧化基因表達以抵抗線粒體損傷和細胞凋亡[22-23]。甲烷可降低氧化應激標志物8-羥化脫氧鳥苷、4-羥壬烯醛、MDA5水平，增加SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，減小視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后發(fā)生RGC凋亡、視網(wǎng)膜變薄的可能性[24]。敲除Nrf2基因可加重視網(wǎng)膜缺血-再灌注后RGC的損傷，最終導致視覺障礙[25-26]。另外，視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后視網(wǎng)膜組織Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達明顯升高，在7 d后回落，表明損傷后Nrf2/HO-1信號通路的適應性激活是暫時的[27]。鑒于以上研究結(jié)果，我們推測Nrf2/HO-1信號通路的激活可能在早期視網(wǎng)膜損傷中起重要作用。本研究結(jié)果表明，爆震傷后48 h內(nèi)視網(wǎng)膜損傷不斷加重，相關(guān)Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達持續(xù)升高，誘發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)源性氧化應激反應，且隨著時間推移，損傷從視網(wǎng)膜內(nèi)層向外蔓延，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[28-29]。

綜上所述，Nrf2/HO-1信號通路介導的氧化應激反應參與早期視網(wǎng)膜爆震傷的發(fā)生，其作用機制與上調(diào)SOD2蛋白、MDA5蛋白、iNOS蛋白表達有關(guān)。據(jù)此推測，干預Nrf2/HO-1信號通路可能預防或治療視網(wǎng)膜爆震傷。