胡輝 ，沈雙雙 ，藍小芳 ，張向東 ，徐夏苑 ，靳春雷 ，雷永良 ，劉姣 *

（1.麗水市婦幼保健院，浙江 麗水 323000；2.金華市婦幼保健院，浙江 金華 321000）

室間隔缺損（VSD）是兒童最常見的先天性心臟?。–HD），占新生兒心臟畸形的25%～30%，患病率1.7%～3.0%[1]。目前已知染色體非整倍體和染色體拷貝數(shù)變異（CNV）可導致CHD[2]，但上述病因與輕微先天性心臟?。ㄈ鐔渭冃蚔SD）之間的關聯(lián)無法確定。染色體微陣列分析（CMA），如單核苷酸多態(tài)性微陣列分析（SNP array），可同時檢測全基因組水平上染色體異常和亞微觀基因組失衡，已被推薦用于胎兒結(jié)構(gòu)異常的遺傳學一線檢測[3]。本研究應用傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析聯(lián)合SNP array分析VSD胎兒遺傳學病因，并觀察VSD胎兒的妊娠結(jié)局及預后，旨在探討VSD的遺傳學病因及CMA技術在VSD胎兒中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月-2019年12月經(jīng)產(chǎn)前診斷中心超聲診斷為VSD 69例胎兒，其中麗水市婦幼保健院43例，金華市婦幼保健院26例。納入標準：（1）產(chǎn)前超聲診斷為VSD胎兒；（2）孕婦及家屬均對研究知情。排除標準：（1）孕婦有遺傳性疾病家族史；（2）孕婦合并嚴重妊娠期疾病或接觸不良環(huán)境者；（3）臨床資料不完整者；（4）配合度低，難以隨訪及完成數(shù)據(jù)收集者。根據(jù)“是否合并其他心臟結(jié)構(gòu)異?！狈譃閱渭冃蚔SD組（33例）和非單純型VSD組（36例），后者包括法洛氏四聯(lián)癥8例、合并肺動脈狹窄6例、合并房間隔缺損4例、完全性房室間隔缺損3例、合并三尖瓣返流3例及合并其他畸形12例。兩組妊娠期間均無感染、嚴重妊娠期高血壓及糖尿病等病史。兩組孕婦年齡、胎兒孕周差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1。本研究經(jīng)上述兩家醫(yī)院各自倫理委員會審批通過，且婦知情同意。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

組別 n 年齡（歲） 孕周單純型 VSD 組 33 28.5±8.3 24.3±6.5非單純型 VSD 組 36 27.8±9.2 24.2±7.1

1.2 方法 對所有胎兒進行染色體核型分析和SNP array檢測，根據(jù)接受產(chǎn)前診斷的孕周分別通過羊水路徑、臍血路徑獲取胎兒樣本，并收集胎兒父母外周血備用。分析候選致病基因并對生產(chǎn)結(jié)局和胎兒發(fā)育情況進行隨仿。記錄是否合并心臟外結(jié)構(gòu)異?；虺曑浿笜水惓＃∟T異常、單臍動脈、脈絡膜囊腫等。

1.2.1 染色體分析 （1）染色體核型分析。孕26周以下在無菌條件下抽取20mL羊水，采用胰蛋白酶消化法常規(guī)行羊水細胞培養(yǎng)、收獲、制片，G顯帶；孕26周以上取1～2mL臍血標本接種培養(yǎng)、收獲、制片、G顯帶，顯微鏡下計數(shù)20個細胞，如果發(fā)現(xiàn)性染色體異常應加倍計數(shù)，如懷疑嵌合體，則加數(shù)到100個細胞，分析5個核型。（2）CMA。①基因組DNA提?。翰捎玫聡鳴iagen DNA試劑盒提取羊水、臍血或外周血基因組DNA。②CMA檢測：采用美國Affymetrix公司的SNP array檢測平臺和Cyto Scan 750 K芯片檢測的標準操作流程，分別進行基因組DNA的消化、連接、擴增、純化、片段化、標記、雜交、洗滌及掃描，應用ChAS軟件進行數(shù)據(jù)分析。檢測 CNV 依據(jù) DGV、OMIM、UCSC、DECIPHER 等公共數(shù)據(jù)庫進行比對分析，同時依據(jù)CNV檢測出性質(zhì)，分成致病性CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV（VOUS）、可能良性CNV與良性CNV。由于樣本量限制，本研究將可能致病CNV、臨床意義不明 CNV及可能良性 CNV歸類于 VOUS，對VOUS胎兒父母外周血樣本進一步行SNP array檢測，明確胎兒CNV來源以協(xié)助判斷CNV的性質(zhì)。比較兩組染色體核型異常情況，以及致病性CNV、VOUS、良性CNV與未發(fā)現(xiàn)CNV的構(gòu)成情況。

1.2.2 候選基因的篩選 使用以下標準：（1）在正常胎兒心臟組織和細胞系中有蛋白表達。使用Proteomics DB 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteomicsdb.org/）、Eurexpress數(shù)據(jù)庫（http://www.eurexpress.org/ee/）、小鼠基因組信息學數(shù)據(jù)庫中的基因表達數(shù)據(jù)庫（http://www.informatics.jax.org/expression.shtmL）；（2）參與心臟系統(tǒng)發(fā)育相關通路的基因和心血管系統(tǒng)發(fā)育過程中富集的基因。使用Netpath數(shù)據(jù)庫（http://www.netpath.org/）；（3）有先天性心臟病相關基因的文獻；（4）小鼠基因組信息數(shù)據(jù)庫中顯示心血管表型異常的基因；（5）基因劑量敏感性查詢。使用ClinGen數(shù)據(jù)庫（https://dosa ge.clinicalgenome.org/index.shtmL）、ExAC 數(shù) 據(jù) 庫 （http://exac.broadinstitute.org）。

1.2.3 隨訪情況 （1）引產(chǎn)情況。觀察并記錄所有胎兒妊娠結(jié)局和引產(chǎn)數(shù)。（2）合并心外異常情況。（3）VSD自然閉合。1周歲前復查幼兒心臟超聲，比較兩組幼兒VSD自然閉合情況。（4）發(fā)育情況。1周歲時，依據(jù)《WHO兒童生長發(fā)育標準（2006年版）》[4]行體格發(fā)育評估，包括頭圍、體質(zhì)量、身高。其中一項小于同性別、同年齡兒童中位數(shù)減2個標準差評為“體格發(fā)育落后”。運用《0-6歲兒童神經(jīng)心理發(fā)育量表》[5]進行智力評估，從大運動、精細動作、適應能力、語言、社交行為五個方面進行評估，計算發(fā)育商（DQ），DQ＜70，評為“智力低下”。比較兩組體格發(fā)育落后和智力發(fā)育落后的情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率表示，組間差異比較采用χ2檢驗或Fisher’s檢驗。

2 結(jié)果

2.1 遺傳學檢測 69例VSD的胎兒中，10例（14.5%）染色體核型異常，其中染色體數(shù)目異常7例（18-三體綜合征4例、21-三體綜合征3例），染色體結(jié)構(gòu)異常3例，兩組染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余59例行CMA分析，發(fā)現(xiàn)兩組致病性 CNV、VOUS、良性 CNV檢出率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組室間隔缺損胎兒的遺傳學檢測結(jié)果[n（%）]

2.2 CMA分析

2.2.1 染色體核型結(jié)構(gòu)異?；純篊MA分析 3例核型結(jié)構(gòu)異常片段的大小及精確位點，其中1例（編號1）染色體異常片段包含Wolf-Hirshhorn綜合征的關鍵區(qū)域；1例（編號3）染色體異常片段包含1q43-q44缺失綜合征的關鍵區(qū)域。詳見表3。

表3 染色體核型結(jié)構(gòu)異常VSD胎兒CMA結(jié)果

2.2.2 染色體結(jié)構(gòu)正?；純篊MA分析 核型正常的VSD胎兒中檢測出CNV 11例（15.9%），其中7例通過父母驗證發(fā)現(xiàn)2例來源于母親；11例中致病性 CNV 5例（7.2%），VOUS占4例（5.8%）；良性CNV有2例（2.9%）。致病性CNV中4例為已知的微缺失/微重復綜合征（16p13.11微缺失綜合征、DiGeorge綜合征、22q11.2遠端缺失綜合征、1p36缺失綜合征），另1例致病性CNV丟失片段大于10Mb，缺失片段包含多個已知致病基因。詳見表4。

表4 染色體核型結(jié)構(gòu)正常檢出CNV胎兒CMA結(jié)果

2.3 候選基因的篩選 本文分析了與CHD相關的致病性CNV中以顯性方式發(fā)揮作用的基因，通過基因功能富集分析篩選出7個CHD候選基因，其 中 TBX1、CRKL、DGCR6、MAPK1 位 于 22q11.2區(qū)段上；PRDM16、SKI、MYH11 分別位于 1p36.32、1p36.33-p36.32、16p13.11區(qū)段上。詳見表5。

表5 CHD候選基因

2.4 隨訪及預后 69例VSD胎兒中共24例引產(chǎn)，非單純型VSD組引產(chǎn)率52.8%（19/36）明顯高于單純型VSD組15.2%（5/33），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。合并心外異常率兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。非單純型VSD組17例胎兒分娩并存活，單純型VSD組28例胎兒分娩并存活；隨防至幼兒1周歲，VSD自然閉合者單純型VSD組占10例（30.3%），非單純型VSD組占2例（5.6%），單純型VSD組自然閉合率高于非單純型VSD組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1周歲時幼兒體檢共發(fā)現(xiàn)體格發(fā)育落后3例，智力發(fā)育落后2例，兩組體格、智力發(fā)育落后情況比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 詳見表 6。

表6 兩組隨訪情況[n（%）]

3 討論

高達90%的18-三體綜合征患者合并CHD，其最常見的心臟缺陷類型為間隔缺損和動脈導管未閉[6]。在21-三體綜合征患者中，VSD發(fā)生率為14%～27%[7]。本研究中經(jīng)染色體核型分析也發(fā)現(xiàn)，最易合并VSD的非整倍體異常為18-三體綜合征和21-三體綜合征。與傳統(tǒng)的核型分析相比，CMA在檢測和識別CNV方面均具有較高的準確性和分辨率，越來越多的研究推薦將CMA用于CHD產(chǎn)前診斷[8]。利用CMA檢測可進一步明確染色體核型結(jié)構(gòu)異常片段的大小及精確位點。本研究明確1號病例和3號病例染色體結(jié)構(gòu)異常片段分別包含Wolf-Hirshhorn綜合征和1q43-q44缺失綜合征的關鍵區(qū)域。在核型正常的胎兒中CMA額外檢測出核型無法識別的16p13.11微缺失綜合征、DiGeorge綜合征、22q11.2遠端缺失綜合征，進一步證明這些微缺失、微重復綜合征也是VSD的重要遺傳學病因，通過父母驗證有助于致病性的判定及明確致病性CNV的來源。CMA額外提高7.2%VSD病因檢出率，提示該技術適用于VSD的遺傳學病因診斷。本研究結(jié)果顯示單純型VSD組較非單純VSD組核型數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常率無顯著性差異。非單純VSD組致病性CNV較單純型VSD無增加，結(jié)果與鄧瓊等[9]研究一致。

研究發(fā)現(xiàn)，全基因組CNV可影響基因的劑量水平或改變基因功能，與CHD密切相關[10]。由于CNV可改變多個連續(xù)基因的劑量，不僅導致CHD，還可引起其他臟器的發(fā)育異常。通過數(shù)據(jù)庫和文獻檢索分析致病性CNV中包含的基因，綜合分析基因單倍劑量敏感性、基因在人體和動物模型中的定位及文獻報道基因功能等資料有助于CHD候選基因的篩選。本研究共發(fā)現(xiàn)7個CHD候選基因。病例5為22q11.2片段缺失導致的DiGeorge綜合征，該病臨床表型包括CHD、顱面部畸形、神經(jīng)系統(tǒng)障礙、胸腺發(fā)育不良或缺如等。DiGeorge綜合征患者中CHD的發(fā)病率約為60%～80%[11]，最常見的CHD類型為法洛氏四聯(lián)癥，而VSD是法洛氏四聯(lián)癥的缺陷之一。22q11.2區(qū)段包含50多個基因，其中與心臟細胞增殖發(fā)育有關的TBX1基因是以往研究的焦點，被認為是該病最主要的致病基因。近年來越來越多報道顯示，除了TBX1以外，CRKL、DGCR6也是導致22q11.2缺失綜合征患者心臟表型的重要病因。TBX1+/-，CRKL+/-的復合雜合變異小鼠通常會出現(xiàn)更嚴重的心臟缺陷[12]，表明TBX1和CRKL基因可能存在相互作用，共同影響心臟發(fā)育。在雞模型研究中，發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的反義轉(zhuǎn)導對神經(jīng)嵴細胞DGCR6的抑制導致了與DGS相似的嚴重心血管異常的高發(fā)，提示DGCR6可能作為TBX1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子而發(fā)揮作用[13]。病例6為22q11.2遠端缺失綜合征，以往研究顯示本病最常見的CHD類型為VSD，位于LCR22-4和LCR22-5之間的MAPK1基因被認為是引起心臟發(fā)育異常的致病基因[14]。在馬凡綜合征小鼠模型中，MAPK1被激活，而通過選擇性抑制MAPK1激活可改善小鼠主動脈生長[15]。1p36缺失綜合征和16p13.11微缺失綜合征所缺失片段中包含的PRDM16[16]、SKI[17]及MYH11[18]基因，上述基因在動物實驗中被證實為參與心臟發(fā)育的劑量敏感基因，可能是CHD的候選基因，部分可能與VSD發(fā)育有關，具體機制有待進一步研究。本研究顯示，CMA檢測較傳統(tǒng)的核型分析可明確染色體異常片段的大小及精確位點。并可通過基因富集和路徑分析來了解CNV及相關基因與心臟發(fā)育的潛在相關性，初步篩選出CHD潛在的候選基因。

隨訪結(jié)果顯示，兩組合并心外異常率無差異，而非單純VSD組引產(chǎn)率較單純VSD組增加，可能因非單純VSD合并其他嚴重的心臟畸形，增加了預后不良的風險，影響孕婦繼續(xù)妊娠的信心。研究結(jié)果顯示，1歲內(nèi)單純型VSD自然閉合率達30.3%，可見部分室間隔延遲閉合可能屬于正常的變異。以往認為VSD對患兒出生后體格發(fā)育有較大的影響，而本研究發(fā)現(xiàn)，僅3例VSD患兒體格發(fā)育落后，可能與醫(yī)療水平的發(fā)展、VSD得到及時修補、生活衛(wèi)生環(huán)境的改善等綜合因素有關。本研究中兩組各1例出現(xiàn)智力發(fā)育落后情況，說明VSD患兒有合并智力低下的可能，其機制有待進一步研究。

存在VSD的胎兒應進一步分析其染色體情況并行CMA檢查，明確是否合并致病基因型，加強隨訪，為產(chǎn)前診斷提供更準確的依據(jù)。