張 巖, 白音巴圖, 于泊洋, 楊 錚, 云 霞， 任向宇， 劉陶迪△

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室， 呼和浩特 010110)

精子發(fā)生是指從精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)發(fā)育到成熟精子的過程，該過程發(fā)生在成年雄性哺乳動物的睪丸內(nèi)，SSCs的自我更新與分化是正常精子發(fā)生的基礎(chǔ)[1]。SSCs作為一種成體干細(xì)胞需要與曲細(xì)精管內(nèi)的體細(xì)胞(如支持細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞)配合來平衡其自我更新與分化，既能夠避免干細(xì)胞的枯竭又能夠為雄性哺乳動物一生源源不斷的提供精子發(fā)生[2]。自2003年Kanatsu-Shinohara研究組[3]成功建立了小鼠SSCs的體外長期培養(yǎng)體系以來，經(jīng)過十余年的發(fā)展，體外培養(yǎng)的SSCs得到了廣泛而深入的研究和發(fā)展，既可以用來制備轉(zhuǎn)基因動物[3，4]，也可在體外誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞[5，6]及用來在人類進(jìn)行自體移植(主要是未成年患者)恢復(fù)生育能力[7]。然而SSCs在雄性哺乳動物睪丸內(nèi)的數(shù)量極為稀少，約占成年小鼠睪丸生殖細(xì)胞總數(shù)的0.03%[8]。因此采用一個高效的分離方法，得到穩(wěn)定的SSCs，對于SSCs的體外操作是極為重要的前提保障。目前，SSCs的分離純化采用最多的就是免疫磁珠法[9-11]和差異貼壁法[12-14]。本實驗以小鼠SSCs (mSSCs)為研究對象，分別采用這兩種方法進(jìn)行分離純化，并詳細(xì)比較兩種方法的純化效果，并對這兩種方法在實踐應(yīng)用中的優(yōu)缺點和適用性進(jìn)行分析和總結(jié)，為SSCs進(jìn)一步的深入研究奠定基礎(chǔ)，同時也為人SSCs的體外研究和將來的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MEMα培養(yǎng)液、DMEM/F12培養(yǎng)液和雙抗(Pen Strep)均購于Gibco公司。β巰基乙醇、Laminin,牛血清白蛋白(BSA)和馬血清購于Sigma公司。 生長因子GDNF，GFRa1和bFGF均購于R&D公司。Collagenase Ⅳ(Worthington)，Trypsin(Amresco), EDTA和DNase Ⅰ(上海生工)。thy-1抗體偶聯(lián)的免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，胎牛血清(TBD)，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純制品。實驗所用一抗有：兔抗鼠CDH1 IgG一抗和山羊抗鼠GFRα1 IgG一抗(Santa Cruz)。實驗所用二抗和Hochest33342均購自武漢博士德生物工程有限公司，二抗有：cy3偶聯(lián)的抗小鼠IgG，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的抗兔IgG。

1.2 曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液的制備

曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液的制備采用已報道的“兩步酶消化法”[15]，具體過程如下。將10只12～15日齡的雄性C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下摘出睪丸。將睪丸置于無菌培養(yǎng)皿并去掉白膜暴露出曲細(xì)精管，收集所有的曲細(xì)精管置于事先準(zhǔn)備好的裝有DMEM/F12培養(yǎng)液的小瓶中。在瓶中加入Collagenase Ⅳ和DNase Ⅰ，37℃水浴搖床孵育15 min。離心棄上清，并用DPBS清洗兩次。加入Trypsin/EDTA溶液，37℃水浴搖床孵育5 min，反復(fù)吹打使其形成單細(xì)胞懸液。當(dāng)絕大多數(shù)細(xì)胞已吹散時，立刻加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)。去除肉眼可見的大組織塊，將上述培養(yǎng)液分別通過200目和300目的尼龍膜過濾，將細(xì)胞濾液以2 000 r/min離心5 min，DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸，得到曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3 差異貼壁法純化精原干細(xì)胞

差異貼壁法是利用曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液中各種不同細(xì)胞表面的貼壁能力不同而進(jìn)行分離[15]。具體過程(圖1A)如下：將得到的單細(xì)胞懸液接種在4～6個明膠處理過的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種濃度約為2×106個細(xì)胞/皿，32.5℃，5.5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)65 h。65 h后拿出培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)液，每個培養(yǎng)皿中加入8 ml DMEM/F12培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿表面溫和地反復(fù)吹打，收集懸浮細(xì)胞。由于不同的表面粘附力，懸浮細(xì)胞中絕大多數(shù)為生殖細(xì)胞，體細(xì)胞仍然貼壁在培養(yǎng)皿底部。為了盡可能的收集生殖細(xì)胞，重復(fù)該步驟兩次。將收集到的生殖細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min。DMEF/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。提前一夜用鼠尾膠原包被兩個100 mm培養(yǎng)皿，將細(xì)胞懸液加到鼠尾膠原包被過的培養(yǎng)皿中，32.5℃，5.5% CO2培養(yǎng)4 h。4 h后，取出培養(yǎng)皿，收集未貼壁細(xì)胞到一個50 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min。DMEF/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，把細(xì)胞懸液接種到至少提前4 h準(zhǔn)備好的鋪有l(wèi)aminin的12孔板中，32.5℃，5.5% CO2培養(yǎng)45 min。45 min后棄培養(yǎng)液，加入PBS-BSA溶液使Laminin粘著的未分化精原細(xì)胞脫壁。收集所有浮起的細(xì)胞到一個50 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并計數(shù)。

Fig. 1 Purification of mousespermatogonial stem cells (mSSCs)A: Purification of mSSCs by differential attachment method, using the differences of SSCs, somatic cells (support cells and a small number of pericyte cells) and other spermatogenic cells of adherence to different media; B: The mSSCs are purified by immunomagnetic bead method. The specific antigen Thy1 on the surface of mSSCs can be combined with the specific monoclonal antibody connected to the magnetic beads. In an external magnetic field, the cells connected to the magnetic beads through the antibody are adsorbed and stay in the magnetic field. Cells without surface antigens have no magnetism because they cannot bind to a specific monoclonal antibody connected to magnetic beads, and do not stay in a magnetic field, so that cells can be separated

1.4 免疫磁珠法純化精原干細(xì)胞

mSSCs細(xì)胞表面具有的特異抗原Thy1能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合[10]，在外加磁場中，帶有抗原Thy1的細(xì)胞被磁珠上抗體吸附而滯留在磁場中，無表面抗原Thy1的細(xì)胞由于不能與連接在磁珠上的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。在進(jìn)行免疫磁珠分離前，曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液首先經(jīng)30% percoll密度梯度離心，DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，再利用免疫磁珠法進(jìn)行分離(圖1B)。根據(jù)細(xì)胞懸液的體積加入1/50體積的PE-抗-Thy1單抗，冰浴，每107細(xì)胞按照9∶1的比例加入抗PE磁珠，冰浴，加入10倍體積磁珠分選緩沖液洗滌兩次，加入1 ml磁珠分選緩沖液，過柱，待陰性細(xì)胞通過分選柱后，從分選器內(nèi)取出分選柱，置于15 ml離心管上，滴加5 ml緩沖液于柱上，利用活塞沖洗出陽性細(xì)胞，離心，棄上清，精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸備用。

1.5 小鼠SSCs體外長期培養(yǎng)和生長曲線測定

將新鮮純化的mSSCs以5×105cells/ml的濃度接種到以絲裂霉素處理的STO(SIM mouse embryo-derived thioguanine and ouabain resistant)細(xì)胞為滋養(yǎng)層的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。分別在無血清成分明確的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入生長因子GDNF、GFRa1和 bFGF，使其終濃度為20 ng/ml,150 ng/ml和10 ng/ml，置于37℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中，每隔一天換一次培養(yǎng)液。在原代培養(yǎng)后的6～9 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以后每隔6～9 d依SSCs和滋養(yǎng)層的生長狀況進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)并計數(shù)。兩種方法純化得到的mSSCs均可在體外連續(xù)培養(yǎng)超3個月，傳代15代以上。

1.6 小鼠SSCs細(xì)胞的鑒定

取出體外連續(xù)培養(yǎng)超3個月的mSSCs，DPBS沖洗，加入4%多聚甲醛溶液固定。用含10%正常山羊血清的封閉液室溫封閉，封閉后直接加入一抗4℃共孵育，過夜。DPBS沖洗，在完全避光的條件下加入二抗室溫孵育30 min。DPBS沖洗，加入Hochest 33342室溫孵育8 min。DPBS沖洗，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。本研究使用的一抗有兔抗鼠CDH1 IgG一抗和山羊抗鼠GFRα1 IgG一抗，mSSCs為陽性細(xì)胞與二抗偶聯(lián)后會呈現(xiàn)出綠色和紅色熒光標(biāo)記，而STO滋養(yǎng)層細(xì)胞則不會被標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 差異貼壁法和免疫磁珠法分離純化mSSCs的結(jié)果

經(jīng)兩種方法分離純化后的mSSCs均可在以STO細(xì)胞為滋養(yǎng)層、添加生長因子而無血清的培養(yǎng)體系中連續(xù)培養(yǎng)超6個月，傳代超30代。原代培養(yǎng)的mSSCs生長緩慢，大約經(jīng)過3次1∶1～1∶1.5傳代培養(yǎng)后細(xì)胞逐漸進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，開始增殖(圖2)。原代培養(yǎng)48 h后mSSCs開始貼附于滋養(yǎng)層細(xì)胞上(圖2 A, B)。5 d時經(jīng)差異貼壁法純化得到的mSSCs開始形成集落(圖2C)，經(jīng)免疫磁珠法純化得到的的mSSCs也開始增殖，但沒有觀察到明顯的細(xì)胞集落(圖2D)。傳代培養(yǎng)三次以后經(jīng)兩種方法純化得到的的mSSCs逐漸進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，以后視滋養(yǎng)層和mSSCs的生長狀況每隔6～9 d以1∶2～1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，1個月后可看到典型的葡萄串狀克隆，并可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)超過3個月(圖2E, F)。

Fig. 2 In vitro proliferation and morphological observation of mouse spermatogonial stem cells (mSSCs). mSSCs purified by differential attachment method were cultured in vitro for 48 h (A), 5 d (C) and more than 3 m (E), and mSSCs purified by immunomagnetic bead method were cultured in vitro for 48 h (B), 5 d (D) and more than 3 m (F). The arrows show mSSCs or feeder cells (Feeder). The scale bar is 20 μm

2.2 差異貼壁和免疫磁珠分離方法的比較

2.2.1 細(xì)胞數(shù)量的比較 利用兩步酶消化法，10只小鼠的睪丸經(jīng)處理后可得到2.0×107± 0.1×107個細(xì)胞的曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液(n=5)。12～15 d 齡的小鼠曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液中主要含有未分化的精原細(xì)胞、各級分化的生精細(xì)胞和支持細(xì)胞及少量的管周細(xì)胞等體細(xì)胞。差異貼壁法分離后，經(jīng)過65 h的培養(yǎng)，絕大多數(shù)體細(xì)胞已完成貼壁。收集未貼壁的生殖細(xì)胞，接種到鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿，經(jīng)過4 h的培養(yǎng)后，絕大多數(shù)的已分化細(xì)胞完成貼壁。收集未貼壁細(xì)胞，接種到Laminin包被的培養(yǎng)皿中，40 min后，絕大多數(shù)的未分化精原細(xì)胞完成貼壁， 棄上清，收集貼壁細(xì)胞，計數(shù)。經(jīng)純化后10只小鼠的睪丸可以得到3.0×105± 0.4×105個mSSCs(n=5)，細(xì)胞回收率(純化后細(xì)胞數(shù)曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù))約為1.5%。曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液經(jīng)30% Percoll密度梯度離心后，重懸細(xì)胞，經(jīng)過免疫磁珠分選柱后，利用活塞沖洗出陽性細(xì)胞，離心，重懸，計數(shù)。經(jīng)純化后10只小鼠的睪丸可以得到6.0×105± 0.4×105個mSSCs(n=5)，細(xì)胞回收率約為3%，約為差異貼壁法的二倍。

2.2.2 二種分離方法對細(xì)胞增殖生長影響的比較 經(jīng)差異貼壁法純化得到的mSSCs，原代培養(yǎng)的前3代細(xì)胞生長較緩慢，均以1∶1～1∶1.5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，3～4次傳代培養(yǎng)之后細(xì)胞逐漸進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，開始增殖。經(jīng)免疫磁珠法純化得到的細(xì)胞前幾代較差異貼壁法得到的mSSCs生長更緩慢，但經(jīng)過4～5次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞逐漸穩(wěn)定，開始增殖。兩種純化方法對mSSCs體外長期增殖生長的影響，經(jīng)卡方檢驗無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，圖3)。

Fig. 3 In vitro proliferation curves of mouse spermatogonial stem cells (mSSCs). The mSSCs obtained by differential attachment method (DAM) and immuno magnetic bead method (IMBM) were all cultured from a concentration of 1 × 105 cells/ml. There was no significant difference in the proliferation and growth of SSCs between the two purification methods (P>0.05)

2.3 小鼠精原干細(xì)胞的鑒定

經(jīng)兩種方法純化后的mSSCs在體外培養(yǎng)過程中形成典型的葡萄串狀克隆(圖4 Visible)，經(jīng)免疫熒光染色鑒定均可表達(dá)CDH1和GFRα1(圖4)，而滋養(yǎng)層細(xì)胞則不被染色。這兩個基因均為公認(rèn)的mSSCs的特異性表面標(biāo)記基因[2]，免疫熒光細(xì)胞染色法分析結(jié)果證實本實驗得到的為可在體外長期穩(wěn)定培養(yǎng)的mSSCs。

Fig. 4 Double immunofluorescence staining analysis of mousespermatogonial stem cells (mSSCs ) cultured in vitro. Mouse SSCs can form cell clones (Visible), and single adherent cells are STO feeder cells (arrows). The cell clone was recognized by both anti-GFRα1 (GFRα1) and anti-CDH1 (CDH1) antibodies. Microscopic examination showed fluorescence, while feeder cells were negative. The scale bar is 20 μm

3 討論

開始于雄性哺乳動物青春期的精子發(fā)生是體內(nèi)一個高效、有序、精準(zhǔn)的過程，它起始于SSC，經(jīng)過增殖分化，精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成3個階段發(fā)育為成熟精子，因此深入研究SSC對進(jìn)一步明確精子發(fā)生機(jī)制、對闡述男性不育病因進(jìn)而解決男性不育難題具有深遠(yuǎn)意義[16]。此外，SSC還可以在不添加任何外源基因和病毒的情況下轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞，為再生醫(yī)學(xué)與細(xì)胞治療增添新來源[5,6]。最近，研究者對未成年雙側(cè)隱睪患者的睪丸組織切片進(jìn)行體外增殖并異體移植取得成功，這為SSC在男性先天和獲得性不育癥的治療提供理論依據(jù)[7]。獲得高純度、高活力的SSCs是在體外對SSCs進(jìn)行研究的關(guān)鍵，已報道的mSSCs的純化方法有基于細(xì)胞形態(tài)的篩選法、差異貼壁法、流式細(xì)胞分選法、免疫磁珠分離法等，這些方法在純化效率、經(jīng)濟(jì)成本等方面各有優(yōu)劣[17]。本研究對比兩種使用率和純化效率都高的mSSCs純化方法——差異貼壁法和免疫磁珠法，并且經(jīng)這兩種方法得到的SSCs均可在體外長期培養(yǎng)。

差異貼壁法是利用曲細(xì)精管單細(xì)胞懸液中多種細(xì)胞在細(xì)胞比重和貼壁能力等方面的差異進(jìn)行分離純化。首先在明膠處理的培養(yǎng)皿中，支持細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞等體細(xì)胞的貼壁速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生殖細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，體細(xì)胞大多完成貼壁，而生殖細(xì)胞尚未貼壁或貼壁不牢，輕輕吹打即脫落[13]。收集未貼壁的生殖細(xì)胞接種到鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿中,經(jīng)4 h培養(yǎng)后，分化的生精細(xì)胞優(yōu)先粘附于鼠尾膠原，而未分化的精原細(xì)胞尚未貼壁。收集未貼壁細(xì)胞接種到Laminin包被的十二孔板中，Laminin是曲細(xì)精管基底膜細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一，所以SSCs優(yōu)先粘附于Laminin表面[18，19]，棄上清，收集貼壁細(xì)胞即為mSSCs，每只12～15 d齡的小鼠約可以得到6×104數(shù)量級的未分化精原細(xì)胞。

免疫磁珠法是利用磁珠上的抗體與細(xì)胞上的相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合后形成細(xì)胞-抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，在磁場作用下，使復(fù)合物與未結(jié)合物質(zhì)分離，達(dá)到純化具有特異性抗原的細(xì)胞的目的[10]。因此，高特異性表面抗原是能否高效純化SSCs的關(guān)鍵一步。本研究采用的是THY1+抗體偶聯(lián)的免疫磁珠進(jìn)行分選，該抗體已被多篇文章證實可以得到較純的SSCs細(xì)胞群[20,21]。經(jīng)免疫磁珠技術(shù)進(jìn)行純化的SSCs數(shù)量較差異貼壁法多，大約為差異貼壁法的二倍，每只12～15 d齡的小鼠約可以得到105數(shù)量級的未分化精原細(xì)胞，并且用時短，可在一天之內(nèi)完成純化。

在本研究中，利用兩種方法均可以得到高純的mSSCs，并可用于后續(xù)研究使用，但兩種方法各有優(yōu)缺點。差異貼壁法純化得到的細(xì)胞數(shù)量相對較低(回收率約為1.5%)，但純度更高，可在培養(yǎng)5 d左右即得到干細(xì)胞克隆。純化方法簡單、經(jīng)濟(jì)，無需購買專門的設(shè)備，實用性強(qiáng)，但是細(xì)胞數(shù)量相對較低，并且用時較長，前后需要3 d的時間。免疫磁珠法純化得到的細(xì)胞數(shù)量更大(回收率約為3%)，但是純度相對較低，體外培養(yǎng)約10 d才開始看到明顯的細(xì)胞集落，并且免疫磁珠法主要依賴連接有特異性抗體的磁珠。免疫磁珠法用時較差異貼壁法短，可在1 d內(nèi)完成實驗，但是操作步驟相對復(fù)雜，而且需要購買專門的設(shè)備，每次純化都需要購買含有特異表面標(biāo)記的磁珠，價格也較昂貴。綜上所述，具體采用哪種方法純化SSCs主要取決于材料和用途，如果取材比較珍貴而樣本量又較小時，例如病理過程中采集的人睪丸組織，建議采用靈敏度和回收率都較高的免疫磁珠分離法；如果純化的是珍惜物種的睪丸組織，沒有特異的表面抗原磁珠，則可以選擇差異貼壁法。