高雨桐 吳婭妮 陳銘 張曉琳 韋秀莎 韋曉潔 黃仁彬

摘 要 目的：研究楊桃根活性成分2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環(huán)己二酮（DMDD）對(duì)高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞損傷的改善作用及機(jī)制。方法：將H9c2 心肌細(xì)胞分為正常組、高糖組、滲透壓對(duì)照組和DMDD高、中、低濃度組（8、4、2 μmol/L）。正常組和高糖組細(xì)胞分別加入低糖（含5.5 mmol/L葡萄糖，下同）、高糖DMEM培養(yǎng)基（含33.3 mmol/L葡萄糖，下同）培養(yǎng)48 h;滲透壓對(duì)照組細(xì)胞加入含27.5 mmol/L甘露醇的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;DMDD各濃度組細(xì)胞先加入高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再加入含相應(yīng)濃度DMDD的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中活性氧簇（ROS）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性;采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的水平;采用吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白[活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）]的表達(dá)水平以及核因子κB （NF-κB）/NF-κB抑制蛋白α（IκBα）信號(hào)通路相關(guān)蛋白（NF-κB p65、IκBα）的磷酸化水平。結(jié)果：與正常組比較，高糖組細(xì)胞存活率、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）; ROS、LDH活性，TNF-α、IL-6水平，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01）;細(xì)胞呈橙黃色熒光，且形態(tài)模糊的細(xì)胞明顯增多，表現(xiàn)出明顯的凋亡狀態(tài)。滲透壓對(duì)照組細(xì)胞上述指標(biāo)與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與高糖組比較，DMDD各濃度組細(xì)胞上述指標(biāo)活性或水平（低濃度組細(xì)胞存活率、LDH活性除外）均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）;細(xì)胞中橙黃色熒光明顯減少，細(xì)胞形態(tài)較完整。結(jié)論：DMDD可改善高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷;其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB/IκBα通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環(huán)己二酮;糖尿病心肌病;H9c2心肌細(xì)胞;凋亡;NF-κB/IκBα信號(hào)通路

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of 2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione （DMDD） from Averrhoa carambola on H9c2 myocardial cell injury induced by high glucose and its mechanism. METHODS： H9c2 myocardial cells were divided into normal group， high glucose group， osmotic pressure control group， DMDD high， medium and low concentration groups （8， 4， 2 μmol/L）. Normal group and high glucose group were treated with low glucose DMEM medium （containing 5.5 mmol/L glucose， similarly hereinafter） and high glucose DMEM medium （containing 33.3 mmol/L glucose， similarly hereinafter） for 48 h， respectively. The cells in osmotic pressure control group were cultured in low glucose DMEM medium containing 27.5 mmol/L mannitol for 48 h. In DMDD groups， cells were cultured in high glucose DMEM medium for 24 h， and then in high glucose DMEM medium containing corresponding concentration of DMDD for 24 h. At the end of cell culture， MTT method was used to detect the cell survival rate. The activities of ROS， GSH-Px and LDH in cell supernatant were detected by using related kits. ELISA assay was used to detect the levels of TNF-α and IL-6 in cell supernatant. Cell apoptosis was detected by acridine orange/ethidium bromide （AO/EB） staining. Western blot assay was used to detect the expression of apoptosis related proteins （cleaved caspase-3， Bcl-2， Bax） and the phosphorylation level of nuclear factor κB （NF-κB）/NF-κB suppressor protein α （IκBα） signaling pathway related proteins （NF-κB p65， IκBα）. RESULTS： Compared with the normal group， survival rate， the activity of GSH-Px and protein expression of Bcl-2 in high glucose groups were decreased significantly （P<0.01）; the activities of ROS and LDH， the levels of TNF-α and IL-6， the protein expression of Bax and cleaved caspase-3， and the phosphorylation level of NF-κB p65 and IκBα were increased significantly （P<0.01）; the cells showed orange yellow fluorescence， and the number of cells with fuzzy morphology increased significantly， showing an obvious apoptotic state. There was no statistical significance in above indexes of osmotic pressure control group compared with normal group. Compared with high glucose group， the activities or levels of above indexes （except for cell survival rate an LDH activity in low concentration group） were reversed significantly in DMDD groups （P<0.05 or P<0.01）; the orange yellow fluorescence in the cells decreased significantly， and the cell morphology was relatively complete. CONCLUSIONS： DMDD can significantly improve H9c2 myocardial cell injury induced by high glucose; the mechanism of which may be associated with suppressing oxidative stress and inflammatory response， regulating the expression of apoptosis related protein and NF-κB/IκBα pathway related protein.

KEYWORDS? ?2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione; Diabetic cardiomyopathy; H9c2 myocardial cell; Apoptosis; NF-κB/IκBα signaling pathway

糖尿病心肌病是一種糖尿病心血管并發(fā)癥，由機(jī)體糖代謝紊亂引發(fā)，可表現(xiàn)出心肌組織結(jié)構(gòu)異常和心功能下降，在疾病末期常伴有充血性心力衰竭和心收縮功能不全，是目前糖尿病患者死亡的主要原因[1]?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞損傷所致的凋亡是糖尿病心肌病產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，在整個(gè)疾病發(fā)生和發(fā)展過程中持續(xù)存在并扮演重要角色[2]。然而糖尿病心肌病的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其與高糖引起的非酯化脂肪酸累積、活性氧簇（ROS）聚集、炎癥反應(yīng)及自噬紊亂等有關(guān)[3-4] 。因此，研發(fā)能有效緩解高糖所致心肌細(xì)胞損傷的藥物，對(duì)于防治糖尿病心肌病具有十分重要的意義。

2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環(huán)己二酮（2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione，簡(jiǎn)稱為“DMDD”）是本課題組首次從酢漿草科植物楊桃根Averrhoa carambola L.中分離出的一種活性成分[5]，具有降血糖、改善血脂代謝、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[6-7]。經(jīng)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMDD可明顯改善糖尿病心肌病模型小鼠的心肌損傷，但其具體作用機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路能調(diào)控H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)生理或病理過程，進(jìn)而影響心肌損傷，是治療糖尿病心肌病的潛在靶點(diǎn)[8]?；诖?，本研究以高糖誘導(dǎo)建立H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，研究DMDD對(duì)模型細(xì)胞的存活率、氧化應(yīng)激相關(guān)因子[ROS、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）]、炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）]、凋亡相關(guān)蛋白[活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）]以及核因子κB（NF-κB）/NF-κB抑制蛋白α（IκBα）信號(hào)通路相關(guān)蛋白（NF-κB p65、IκBα）的影響，以期為DMDD治療糖尿病心肌病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有311型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Micro CL17R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），1450型生物超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），CKX-41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），SpectraMaxPlus384型多功能酶標(biāo)儀（香港分子儀器有限公司），Odysse Clx型雙色紅外熒光成像儀（美國(guó)Li-COR公司），Mini PROTEAN?Tetra Cell型電泳槽（美國(guó)Bio- Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用DMDD由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度不低于80%;低糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（批號(hào)分別為8120459、2120539）均購自美國(guó)Gibco公司;青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、MTT試劑（批號(hào)分別為20190306、20200804、715F0527）均購自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（批號(hào)A58G00J）購自美國(guó)Gemini公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)P0010S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗GAPDH多克隆抗體、兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗IκBα多克隆抗體（批號(hào)分別為00083125、00077110、00089105、00093692、00091696）均購自美國(guó)Proteintech公司;兔抗NF-κB p65多克隆抗體（批號(hào)CN89330）購自南京巴傲得生物科技有限公司;兔抗磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、兔抗磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗體、DyLightTM 800熒光標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白二抗（批號(hào)分別為3033S、2859S、5151）均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色試劑盒（批號(hào)0629A20）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;小鼠ROS、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)分別為Oct2019、Oct2019、Oct2019）購自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司;LDH檢測(cè)試劑盒、GSH-Px檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為20190910、20190905）均購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基（含5.5 mmol/L葡萄糖，下同）中，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達(dá)70%～80%時(shí)，以含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組、造模與給藥

參考文獻(xiàn)[9]的方法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞分為正常組、高糖組、滲透壓對(duì)照組（以考察由高糖引起的滲透壓改變是否會(huì)造成細(xì)胞損傷）和DMDD高、中、低濃度組（8、4、2 μmol/L，濃度根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置）。正常組和高糖組細(xì)胞分別加入低糖、高糖（含33.3 mmol/L葡萄糖，下同）DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;滲透壓對(duì)照組細(xì)胞加入含27.5 mmol/L甘露醇的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;DMDD各濃度組細(xì)胞先加入高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再加入含相應(yīng)濃度DMDD的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 H9c2心肌細(xì)胞存活率的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，另設(shè)不含培養(yǎng)基和細(xì)胞的空白組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入含 10% MTT的低糖DMEM 培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，避光振蕩15 min;采用酶標(biāo)儀于 490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）×100%]。

2.4 H9c2心肌細(xì)胞上清液中ROS、GSH-Px和LDH活性的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min;取上清液，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，然后采用酶標(biāo)儀分別于450、412、450 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)細(xì)胞上清液中ROS、GSH-Px、LDH的活性。

2.5 H9c2心肌細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平的檢測(cè)

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項(xiàng)下分組、造模與給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min;取上清液，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的水平。

2.6 H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

采用AO/EB染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，以1×105 mL-1的密度接種于6孔板中，每孔1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，按試劑盒說明書相關(guān)方法染色5 min，然后采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的凋亡情況（AO能透過正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而嵌入細(xì)胞核使細(xì)胞呈綠色熒光;EB僅能透過受損細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而嵌入細(xì)胞核使細(xì)胞呈橘紅色熒光）。

2.7 H9c2心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和NF-κB/IκBα通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，接種到直徑為70 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80% 時(shí)，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，以PBS 洗滌3次，加入裂解液于冰上充分裂解細(xì)胞15 min后，于4 ℃條件下以 12 000 r/min離心15 min;收集上清液，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH的一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;以 TBST 洗滌5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h，置于雙紅外熒光成像儀中成像。采用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行分析，以p-NF-κB p65與NF-κB p65的蛋白灰度值比值、p-IκBα與IκBα的蛋白灰度值比值分別表示NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平，以Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3與內(nèi)參GADPH的蛋白灰度值比值表示3種蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），滲透壓對(duì)照組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD高、中濃度組細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.01），詳見表1。

注：與正常組比較，**P<0.01;與高糖組比較，##P<0.01

Note：vs. normal group，**P<0.01; vs. high glucose group，##P<0.01

3.2 DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞上清液中ROS、GSH-Px和LDH活性的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞上清液中ROS、LDH活性均顯著升高，GSH-Px活性顯著降低（P<0.01），而滲透壓對(duì)照組細(xì)胞上清液中上述指標(biāo)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細(xì)胞上清液中ROS、LDH（低濃度組除外）活性顯著降低（P<0.05或P<0.01），GSH-Px活性均顯著升高（P<0.01），詳見表2。

注：與正常組比較，**P<0.01;與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01

Note：vs. normal group，**P<0.01; vs. high glucose group，#P<0.05，##P<0.01

3.3 DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平均顯著升高（P<0.01），滲透壓對(duì)照組上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

正常組細(xì)胞的細(xì)胞膜光滑，細(xì)胞核完整;高糖組細(xì)胞呈橙黃色熒光，且形態(tài)模糊的細(xì)胞較正常組明顯增多，表現(xiàn)出明顯的凋亡狀態(tài);滲透壓對(duì)照組細(xì)胞無明顯的凋亡狀態(tài);DMDD各濃度組細(xì)胞的橙黃色熒光較高糖組明顯減弱，且細(xì)胞形態(tài)較完整，詳見圖1。

3.5 DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB/IκBα通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01），而滲透壓對(duì)照組上述蛋白表達(dá)水平或磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、圖3、表4。

4 討論

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均是糖尿病心肌病產(chǎn)生、惡化的關(guān)鍵因素;氧化應(yīng)激是由于ROS的過度生成和（或）清除減少，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的ROS相對(duì)過剩;當(dāng)糖尿病患者體內(nèi)的ROS長(zhǎng)期過量時(shí)，會(huì)誘發(fā)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子損傷，進(jìn)而引起心臟炎癥、心肌肥厚及心血管功能的病變，從而誘導(dǎo)糖尿病心肌病的發(fā)生[10-11]。有研究表明，ROS活性的升高在高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡過程中具有重要作用[12]。GSH-Px是機(jī)體的清除劑，能特異性地清除過氧自由基、超氧陰離子等，從而減輕ROS造成的損傷[13]。LDH主要存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，LDH會(huì)泄漏至細(xì)胞外，故可作為反映細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMDD可顯著降低高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞上清液中ROS、LDH的活性，升高GSH-Px的活性。這表明DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的改善作用，可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子IL-6和TNF-α在糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制中也具有重要的作用[8， 14]。當(dāng)糖尿病患者體內(nèi)TNF-α水平升高時(shí)，可損害其胰島素信號(hào)傳導(dǎo)功能和心肌功能;當(dāng)TNF-α水平降低時(shí)，可減輕心肌炎癥和心肌纖維化程度，進(jìn)而改善心功能[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖尿病模型小鼠體內(nèi)IL-6水平降低時(shí)，其心功能改善、間質(zhì)纖維化減輕[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMDD可降低高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平。這表明DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的改善作用，可能與抑制炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

促凋亡因子caspase-3在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用：當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，凋亡信號(hào)通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)匯聚于caspase-3酶原，然后使該酶原發(fā)生裂解、活化，從而獲得凋亡執(zhí)行能力[16]。另外，凋亡的發(fā)生也與Bcl-2蛋白家族密切相關(guān)，其中Bcl-2、Bax之間的動(dòng)態(tài)平衡是界定細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要指標(biāo)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMDD可升高高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)水平，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。這表明DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的改善作用，可能與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激、炎癥時(shí)均可將其激活;IκB蛋白家族是NF-κB的抑制蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB 的p65亞基或p50亞基會(huì)與IκB結(jié)合，從而在細(xì)胞質(zhì)中形成多聚體復(fù)合物，使NF-κB蛋白活性受到抑制;當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IκBα被蛋白酶降解，使得NF-κB與IκB形成的多聚體逐漸解離，最終激活NF-κB信號(hào)通路[9，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，高糖組H9c2心肌細(xì)胞中NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著升高，說明NF-κB/IκBα通路被激活;經(jīng)DMDD干預(yù)后，H9c2心肌細(xì)胞中NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低。這表明DMDD對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的改善作用，可能與抑制NF-κB/IκBα通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，DMDD可改善高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷;其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB/IκBα通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-02-24 修回日期：2021-05-06）

（編輯：唐曉蓮）