劉振方，孫巧玉，孟祥彩，武 玉

(1.石家莊市中醫(yī)院普外科，河北 石家莊050051；2.石家莊市藁城人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 052160；3.秦皇島市第一醫(yī)院普外科，河北 秦皇島 066000)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)為常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占原發(fā)性肝癌的90%，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，HCC患者生存率有所提升，但其發(fā)病率逐年升高，且趨于年輕化[1-2]。因此，臨床迫切需要尋求新的治療方法。微小RNA-130a(Micro RNA-130a，miR-130a)屬于轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度在22～25 nt范圍內(nèi)的非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)[3]。研究顯示，miR-130a在人胃癌組織中高表達(dá)，其可能通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[4]。miR-130a在HCC組織和高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞株中高表達(dá)，沉默HCC細(xì)胞LM3中miR-130a表達(dá)可降低細(xì)胞侵襲能力，提示miR-130a可促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲[5]。

近年來(lái)一些中藥提取物被證實(shí)在抗腫瘤方面具有一定作用，如斑蝥素、槲皮素、羽扇豆醇等。黃芩素(Baicalein)是從中藥黃芩提取的黃酮類化合物。研究顯示，黃芩素可抑制人HCC細(xì)胞SMMC-7721增殖、遷移和侵襲[6-7]。研究顯示，黃芩素聯(lián)合5-氟尿嘧啶可明顯抑制HCC耐藥細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥[8]。但黃芩素能否抑制miR-130a誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞侵襲目前尚不明確。本研究以HCC細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，慢病毒轉(zhuǎn)染法外源性上調(diào)miR-130a，觀察黃芩素在miR-130a誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲中的作用及機(jī)制，為臨床治療HCC提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系：人肝癌HepG2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)C11875500CP)、胎牛血清(FBS，批號(hào)2132094P)和磷酸鹽緩沖液(PBS，批號(hào)AE29431651)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)；總蛋白提取試劑盒、細(xì)胞裂解液(上海碧云天公司)；miR-130a慢病毒載體和空白載體(山東維真生物公司)；慢病毒包裝試劑盒、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體lipofectamine 2000(上海吉瑪公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體(批號(hào)G1220)和鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)抗體(批號(hào)L2330,美國(guó)圣克魯斯公司)；磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)抗體(批號(hào)201001)、羊抗小鼠IgG-HRP(批號(hào)200209)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)Allegra 64R Centrifuge，美國(guó)Beckman Coulter公司)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(型號(hào)CKX41，日本Olympus公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽及轉(zhuǎn)印夾(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號(hào)AI600，美國(guó)GE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10% FBS及1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至70%匯合度進(jìn)行傳代或凍存。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染法外源性上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-130a表達(dá)：HepG2細(xì)胞在12孔板生長(zhǎng)至50%匯合度時(shí)取出細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，更換為含10 μg/ml 聚凝胺的RPMI 1640全培養(yǎng)基，將攜帶綠色熒光標(biāo)簽的miR-130a過(guò)表達(dá)慢病毒液和空載慢病毒液分別稀釋50倍，各吸取50 μl加入細(xì)胞，分別設(shè)為miR-130a組、空載對(duì)照組，不經(jīng)任何處理的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白組，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，更換為RPMI 1640全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合度以嘌呤霉素進(jìn)行篩選，熒光顯微鏡觀察拍照，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-130a表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-130a表達(dá)：將細(xì)胞傳代至10 cm培養(yǎng)皿中，以20 μmol/L的黃芩素處理24 h，收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)各組細(xì)胞總RNA濃度，取1 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并稀釋至500 μl，充分混勻備用。將miR-130a引物按正向引物與反向引物1∶1稀釋，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃、10 s，95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，40個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，2-△△CT法計(jì)算miR-130a的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：取出分裝好的Matrigel膠，以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至250 μg/ml，吸取100 μl稀釋好的Matrigel膠于小室中，將侵襲小室培養(yǎng)板放置到培養(yǎng)箱靜置3 h。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，消化重懸調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×106個(gè)/ml，吸取混合均勻的細(xì)胞懸液200 μl輕輕加入Transwell小室，以20 μmol/L黃芩素處理。在24孔板小室外的下室中加入800 μl含30% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱24 h。24 h后倒掉侵襲小室中的培養(yǎng)基并予PBS清洗2遍，甲醇固定20 min，0.5%結(jié)晶紫水溶液染色20 min，PBS清洗2遍，用棉簽輕輕擦掉小室內(nèi)房細(xì)胞，放置5～10 min風(fēng)干。倒置顯微鏡下觀察，取6個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。

1.2.5 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞MMP-9和Calpastatin蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，于冰盒內(nèi)以RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞10 min，12000 r/min，離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.5 ml EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒定量，制備含蛋白30 μg/10 μl的蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，以12% SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，用MMP-9(1∶1000)、Calpastatin(1∶1000)或Gapdh(1∶1000)于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日孵育羊抗鼠IgG-HRP二抗，以ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，AI600凝膠成像儀下曝光顯影，讀取相應(yīng)蛋白條帶，以目的蛋白灰度值與相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參蛋白灰度值比較得到相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞miR-130a表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1(表1)。熒光顯微鏡下，空載對(duì)照組和miR-130a組均發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，提示慢病毒載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。RT-qPCR結(jié)果顯示，空白組miR-130a表達(dá)水平與空載對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-130a組的miR-130a表達(dá)水平高于空載對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示外源性過(guò)表達(dá)miR-130a 的HepG2細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 各組細(xì)胞miR-130a綠色熒光表達(dá)情況

表1 各組細(xì)胞miR-130a表達(dá)水平比較(%)

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2?？瞻捉M、空載對(duì)照組及miR-130a組細(xì)胞侵襲率分別為100%、(103.9±7.1)%、(385.2±18.1)%，空白組與空載對(duì)照組細(xì)胞侵襲率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-130a組細(xì)胞侵襲率高于空載對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組細(xì)胞侵襲能力比較(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3 各組細(xì)胞MMP-9、Calpastatin蛋白表達(dá)比較 蛋白印跡結(jié)果見(jiàn)圖3?？瞻捉M、空載對(duì)照組及miR-130a組細(xì)胞MMP-9相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為(18.6±3.0)%、(15.8±4.6)%、(121.3±8.8)%，Calpastatin相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為(112.3±8.6)%、(116.5±9.2)%及(27.6±3.1)%。空白組與空載對(duì)照組MMP-9和Calpastatin表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。miR-130a組細(xì)胞MMP-9表達(dá)高于空載對(duì)照組，miR-130a組細(xì)胞Calpastatin表達(dá)低于空載對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖3 各組細(xì)胞MMP-9、Calpastatin蛋白表達(dá)比較

2.4 黃芩素對(duì)miR-130、MMP-9和Calpastatin表達(dá)的影響 見(jiàn)表2(圖4)。黃芩素加miR-130a組的miR-130a表達(dá)水平低于miR-130a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。黃芩素加miR-130a組細(xì)胞MMP-9表達(dá)量低于miR-130a組，黃芩素加miR-130a組細(xì)胞Calpastatin表達(dá)量高于miR-130a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表2 各組細(xì)胞miR-130a、MMP-9、Calpastatin表達(dá)量比較(%)

A：空載對(duì)照組；B:miR-130a組；C：黃芩素加miR-130a組

2.5 各組miR-130a誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲率比較 見(jiàn)圖5。miR-130a組、黃芩素加miR-130a組細(xì)胞侵襲率分別為(335.6±26.2)%、(108.8±7.6)%；黃芩素加miR-130a組細(xì)胞侵襲率低于miR-130a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 各組miR-130a誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲活動(dòng)(結(jié)晶紫染色，×100)

3 討 論

miR-130a作為miRNA的一種，在精子發(fā)生、改善血小板功能及腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用[9-11]。研究顯示，miR-130a在胃癌[4]、肝癌[5]、鼻咽癌[12]及結(jié)直腸癌[13]等惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。有研究表明，miR-130a在HCC中發(fā)揮一定生物學(xué)作用，miR-130a可通過(guò)RUNX3和Wnt信號(hào)通路促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥[14]。另有研究報(bào)道，miR-130a在HCC中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-130a可抑制HCC細(xì)胞的增殖活性，提示miR-130a在HCC中可能發(fā)揮促癌作用[15]。但是，Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)miR-130a通過(guò)下調(diào)Rho-激酶2抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要過(guò)程之一[17]。本研究結(jié)果提示，miR-130a與HepG2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-130a后HepG2細(xì)胞Calpastatin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，MMP-9蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Calpastatin是內(nèi)源性鈣蛋白酶(Calpain,CANP)抑制劑，通過(guò)與CANP形成復(fù)合體的方式抑制CANP活性[18]。提示miR-130a過(guò)表達(dá)后HepG2細(xì)胞胞內(nèi)CANP活性增強(qiáng)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，研究顯示沉默前列腺癌PC3細(xì)胞CANP2表達(dá)后，細(xì)胞MMP-9 表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在CANP-MMP-9信號(hào)通路。且MMP-9能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞組織學(xué)屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。既往有研究報(bào)道，黃芩素能抑制HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[6-8]。因此我們觀察黃芩素在miR-130a誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩素可抑制miR-130a誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲，分子層面研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能抑制miR-130a誘導(dǎo)的Calpastatin表達(dá)下調(diào)以及MMP-9表達(dá)上調(diào)，通過(guò)抑制miR-130a激活的CANP-MMP-9通路降低HepG2細(xì)胞侵襲活動(dòng)。黃芩素作為黃芩提取的黃酮類化合物在抗菌、抗炎、抗氧化及抗腫瘤方面均發(fā)揮一定作用[19]。

綜上所述，黃芩素能抑制miR-130a誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞侵襲，該作用可能與抑制miR-130a誘導(dǎo)的CANP-MMP-9通路活化有關(guān)。本研究處于體外研究階段，需進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。