袁 慧，吳 茜，楚 曼，徐軍建，白艷榮

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712021)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病與機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)失衡及多種炎癥因子大量釋放有關(guān)[1]。大量研究表明，IL-23/IL-17炎癥軸在RA的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，白介素-23(Interleukin-23，IL-23)作用于Th17細(xì)胞，刺激其釋放白介素-17(Interleukin-17，IL-17)， IL-17 募集并激活中性粒細(xì)胞，促使 T 細(xì)胞活化，并刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6(Interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎癥因子的分泌，從而誘發(fā)局部炎癥，且IL-17、TNF-α、IL-6共同參與骨和軟骨的降解過(guò)程[2-3]?；⑼ū詼店兾髦嗅t(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫血液科徐軍建教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)、創(chuàng)立的院內(nèi)制劑，在臨床治療RA方面療效較好、不良反應(yīng)少，且患者依從性好，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，以足跖腫脹程度、關(guān)節(jié)組織病理學(xué)形態(tài)、血清IL-23、IL-17、IL-6及TNF-α為觀察指標(biāo)，初步探討虎威通痹湯對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠IL-23/IL-17炎癥軸的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性健康SD大鼠40只，平均體重(120±20)g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(陜)2018-001。

1.1.2 主要試劑與儀器：甲氨蝶呤片(國(guó)藥準(zhǔn)字H22022674)；0.9%氯化鈉溶液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20044024)；IL-17ELISA試劑盒(批號(hào)H30018353，武漢華美生物工程有限公司)；IL-23ELISA試劑盒(批號(hào)I11018354，武漢華美生物工程有限公司)；TNF-α、IL-6ELISA試劑盒 (批號(hào)p001643、p001867，美國(guó)eBioscience公司)；完全弗氏佐劑(批號(hào)SLBW7430，美國(guó)Sigma公司)；蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑(批號(hào)2017010301、2017040601，北京雷根生物技術(shù)有限公司)；高效液相色譜儀(Prominence型，日本島津公司)；足趾容積測(cè)量?jī)x(PV200型，成都泰盟科技有限公司)；高速離心機(jī)(ZX6006型，法國(guó)Jouan公司)；超薄切片機(jī)(EMUC7型，德國(guó)徠卡公司)；光學(xué)顯微鏡(XSP-C204型，武漢光電儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 虎威通痹湯：由薏苡仁20 g，青風(fēng)藤、龍須藤、忍冬藤、防己、土茯苓、萆薢、桑枝、川牛膝各15 g，山梔子、連翹、威靈仙、虎杖、防風(fēng)、莪術(shù)各10 g，甘草6 g組成。以上中藥由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.2.2 建模、分組與給藥：將40只SPF級(jí)雄性健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、虎威通痹湯組、甲氨蝶呤組，每組10只。除對(duì)照組10只外，其余三組大鼠均予右后足墊一次性皮內(nèi)注射0.1 ml完全弗氏佐劑誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型[4-5]。造模14 d后開始給藥，根據(jù)動(dòng)物體重計(jì)算給藥劑量[6]。甲氨蝶呤組大鼠予1 mg/kg的甲氨蝶呤灌胃，1次/周；虎威通痹湯組大鼠予16 g/kg(折合生藥)的虎威通痹湯灌胃，1次/d；對(duì)照組、模型組大鼠于每日同時(shí)間給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠足跖腫脹度：采用容積法測(cè)量并記錄各組大鼠造模前后及給藥后1、7、14、21、28 d的足容積，并計(jì)算足跖腫脹度，腫脹度為治療前后足跖容積的差值。

1.3.2 HE染色：末次給藥后次日麻醉并處死大鼠，取左后肢膝關(guān)節(jié)滑膜組織于10%甲醛溶液中固定，將固定好的滑膜組織放入石蠟包埋盒中，標(biāo)注時(shí)間及組別，95%乙醇脫水過(guò)夜，切片進(jìn)行HE染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)形態(tài)。

1.3.3 血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平：末次給藥后次日麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，靜置，3000 r/min,離心15 min，分離血清，采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平，所有步驟均按照試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠足跖腫脹度比較 見表1。與對(duì)照組比較，造模后模型組大鼠足跖腫脹度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，甲氨蝶呤組大鼠足跖腫脹度給藥后14 d降低，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度給藥后21 d降低，給藥后28 d足趾腫脹度最低。給藥后28 d，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度低于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠足跖腫脹度比較(mm)

2.2 各組大鼠滑膜組織HE染色 對(duì)照組大鼠滑膜組織相對(duì)完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯；模型組大鼠滑膜組織水腫、增生，可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；虎威通痹湯組、甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織受損情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況均較模型組改善，且虎威通痹湯組優(yōu)于甲氨蝶呤組(圖1)。

圖1 各組大鼠滑膜組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×10)

2.3 各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表達(dá)比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α水平均高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，虎威通痹湯、甲氨蝶呤組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與甲氨蝶呤組比較，虎威通痹湯組大鼠血清IL-23、IL-6均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表達(dá)比較

3 討 論

RA是臨床常見的致殘性疾病，且易合并腦卒中、心肌梗死、肺間質(zhì)纖維化等疾病，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[7-8]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可通過(guò)生物制劑、物理治療等手段穩(wěn)定RA患者病情，但僅延緩病情進(jìn)展，且治療成本較高，不良反應(yīng)較多，因此尋找價(jià)廉效優(yōu)的治療方案有重要意義。

虎威通痹湯在臨床上多用于關(guān)節(jié)炎患者伴肌肉或關(guān)節(jié)紅腫熱痛、有沉重感、步履艱難等病癥的治療。本方立足于“風(fēng)寒濕雜至，合而為痹”的基本理論，選用虎杖、威靈仙共為君藥，虎杖活血散瘀止痛，威靈仙辛散溫通，性猛善走，通行十二經(jīng)，既能袪風(fēng)濕，又能通絡(luò)止痛，為治風(fēng)濕痹痛要藥，兩藥相合，共成祛風(fēng)除濕、活血散瘀止痛之功[9]?！侗静菥V目》云：“藤類藥物以其輕靈,易通利關(guān)節(jié)而達(dá)四肢”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為藤類條達(dá)，可舒筋活絡(luò)，故方中以青風(fēng)藤、龍須藤、忍冬藤為臣，起疏利關(guān)節(jié)之功，正如《本草便讀》云：“凡藤蔓之屬，皆可通經(jīng)入絡(luò)。此物善治風(fēng)疾，故一切歷節(jié)麻痹皆治之”[10]。風(fēng)為百病之長(zhǎng)，佐以防風(fēng)、桑枝疏風(fēng)解表，加強(qiáng)威靈仙之功。久病多瘀，佐以牛膝、莪術(shù)以逐瘀通經(jīng)，加強(qiáng)虎杖散瘀定痛之功。濕熱為發(fā)病之根本，佐以土茯苓、萆薢、薏苡仁、防己利水滲濕、除痹散結(jié)；連翹、山梔子清熱散結(jié)止痛。甘草為中州之藥，能補(bǔ)能和為使，使?jié)袢ザ敛粋?，致于和平也。全方共奏祛風(fēng)、清熱、除濕，活血定痛之功。

IL-23/IL-17炎癥軸在多種自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，IL-6、IL-17的高表達(dá)與RA并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，是RA合并腦卒中、心肌梗死等的危險(xiǎn)因素[11]。動(dòng)物研究證實(shí)，阻斷了IL-23/IL-17炎癥通路，可減輕RA的滑膜炎癥，且大量研究表明IL-17、TNF-α在滑膜炎、骨侵蝕發(fā)揮重要作用，IL-6、TNF-α與RA活動(dòng)程度呈正相關(guān)[12-14]。

大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型是典型的免疫性炎癥模型，是目前最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的RA模型建立方法。故本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型，建模后，模型組大鼠足跖腫脹度高于對(duì)照組，HE染色可見大鼠滑膜組織水腫、增生，提示造模成功。與模型組比較，甲氨蝶呤組大鼠足跖腫脹度給藥后14 d降低，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度給藥后21 d降低，給藥后28 d顯著降低。給藥后28 d，虎威通痹湯組大鼠足跖腫脹度低于甲氨蝶呤組。虎威通痹湯組和甲氨蝶呤組病理結(jié)果均提示：滑膜組織受損情況以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況較模型組明顯改善，說(shuō)明虎威通痹湯對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，且呈時(shí)間依賴性，其療效可能與虎威通痹湯中虎杖[15]、威靈仙[16-17]、土茯苓[18]、連翹[19]等抗炎、鎮(zhèn)痛作用相關(guān)。本研究結(jié)果表明，虎威通痹湯可降低大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，提示虎威通痹湯治療RA的機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞因子IL-6、IL-23、 TNF-α、IL-17分泌有關(guān)。與甲氨蝶呤組比較，虎威通痹湯血清IL-23、IL-6水平降低，提示虎威通痹湯可能通過(guò)抑制IL-23/IL-17炎癥軸發(fā)揮治療作用。

綜上所述，虎威通痹湯可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹程度，減輕滑膜增生，其作用機(jī)制可能與抑制IL-23/IL-17炎癥通路有關(guān)。本研究結(jié)果未進(jìn)行細(xì)胞、分子水平相關(guān)驗(yàn)證，有待今后進(jìn)一步深入研究。