李季，段祥林

武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院骨科，武漢430015

骨肉瘤(OS)是間質(zhì)起源的惡性骨腫瘤，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化和惡性類骨質(zhì)形成，伴有局部腫脹和疼痛。OS是青少年常見的惡性骨腫瘤類型，占青少年惡性腫瘤的5%～10%，是青少年癌癥相關(guān)死亡的第六大原因[1]。OS的主要死亡原因是肺轉(zhuǎn)移，即使經(jīng)過積極治療，OS患者的5年生存率仍低于20%[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200nt，不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子[3]。最近研究表明[4]，在OS發(fā)展過程中一系列的LncRNA分子存在差異性表達(dá)，如LncRNA BC040587、LncRNATUSC7和LncRNA MALAT1等。長鏈非編碼RNA LCPAT1(LncRNA LCPAT1)是最新鑒定的LncRNA分子,研究顯示,其在非小細(xì)胞肺癌[5]和乳腺癌[6]中表達(dá)上調(diào)，且發(fā)揮癌基因的作用。2020年3月—2021年1月，我們探討了LncRNA LCPAT1在OS細(xì)胞系中的表達(dá)、功能及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19和OS細(xì)胞系Saos-2、U-2OS、MG-63均購自美國ATCC細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司。LncRNA LCPAT1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-LCPAT1)和LncRNA LCPAT1沉默表達(dá)質(zhì)粒(LCPAT1-shRNA)及對(duì)照質(zhì)粒由上海吉瑪生物科技有限公司合成，RIPA蛋白質(zhì)提取試劑購自瑞士Roche公司，Transwell侵襲小室購自美國Invitrogen公司，LipofectamineTM3000 試劑購自美國Invitrogen公司，iScriptTMcDNA合成試劑盒購自美國Bio-Rad公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master試劑盒購自瑞士羅氏公司，CCK-8試劑盒購自中國Beyotime生物公司，Annexin-V-FITC檢測試劑盒購自美國BioVision公司和流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，蛋白印跡試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19和OS細(xì)胞系Saos-2、U-2OS、MG-63均接種于含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。嚴(yán)格按照制作商提供的說明書操作，使用LipofectamineTM3000 試劑對(duì)OS細(xì)胞系Saos-2分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- LCPAT1、LCPAT1-shRNA及對(duì)照質(zhì)粒，并分成LCPAT1上調(diào)表達(dá)組(pcDNA3.1- LCPAT1組)、LCPAT1沉默表達(dá)組(sh-LCPAT1組)及對(duì)照組(NC組)，通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h，處理細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 LncRNA LCPAT1表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。使用iScriptTMcDNA合成試劑盒從1 μg分離的總RNA中生成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2.5 μL cDNA模板、1 μL正向引物(10 μmol/L)、1 μL反向引物(10 μmol/L)、10 μL 2×SYBR Green主混合物、5.5 μL ddH2O。反應(yīng)步驟：95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 25 s、72 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)引物如下：LncRNA LCPAT1 正向引物：5′-CCAGACACCTAACCAACTTCC-3′，反向引物:5′-GTGATCTCATCCCTCTTGCTT-3′；GAPDH正向引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力測定 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。將pcDNA3.1-LCPAT1組、NC組及sh-LCPAT1三組細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板(2×104/mL，100 μL/孔)中。在每孔中加入CCK-8試劑10 μL，并于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀于490 nm處測量光密度(OD)值，并以O(shè)D490值表示細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞凋亡能力測定 將pcDNA3.1- LCPAT1組、NC組及sh-LCPAT1組按每組2×105個(gè)細(xì)胞收集于1.5 mL EP管中。在4 ℃以2 000×g離心后，棄上清液。添加500 μL結(jié)合緩沖液使細(xì)胞懸浮，并添加5 μL Annexin V-FITC，并于4 ℃下暗室孵育30 min。然后，加入5 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混合并在室溫下孵育5 min。使用Annexin-V-FITC檢測試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞侵襲能力測定 將pcDNA3.1-LCPAT1組、NC組及sh-LCPAT1組細(xì)胞接種于含有DMEM培養(yǎng)基的Transwell侵襲小室上室中，下室包含補(bǔ)充有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。溫育24 h后，用棉簽除去保留在上膜的細(xì)胞，用甲醇和0.1%結(jié)晶紫固定穿膜細(xì)胞，并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，200倍視野下計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值。

1.7 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用蛋白印跡分析法。用RIPA蛋白質(zhì)提取試劑從pcDNA3.1-LCPAT1組、NC組及sh-LCPAT1組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定蛋白總濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離50 μg蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。在室溫下用5%脫脂奶封閉膜1 h，分別使用相應(yīng)的一抗E-cadherin(1∶200)、N-cadherin (1∶200)、Snail (1∶200)、Twist1(1∶200)和GAPDH(1∶800) 在4 ℃孵育過夜,漂洗3次,每次10 min, 隨后用辣根過氧化物酶HRP兔二抗 (1∶500)室溫孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色。灰度值使用ImageJ V1.49軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 OS細(xì)胞系、正常人成骨細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1 表達(dá)比較 OS細(xì)胞系Saos-2、U-2OS、MG-63及正常人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19中LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.05、0.61±0.03、1.02±0.07、0.13±0.03，OS細(xì)胞系Saos-2、U-2OS及MG-63中LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量高于正常人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19(P均<0.05)。

2.2 LncRNA LCPAT1對(duì)OS細(xì)胞增殖的影響 對(duì)OS細(xì)胞系U-2OS轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LCPAT1質(zhì)粒上調(diào)LncRNA LCPAT1表達(dá)及沉默LncRNA LCPAT1表達(dá)后，pcDNA3.1-LCPAT1組、NC組、sh-LCPAT1組LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量分別為16.3±1.4、8.2±1.2、2.1±0.5，pcDNA3.1-LCPAT1組LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量高于NC組(P<0.05),sh-LCPAT1組LncRNA LCPAT1相對(duì)表達(dá)量低于NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功，可行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)示轉(zhuǎn)染24 h，pcDNA3.1-LCPAT1組、NC組及sh-LCPAT1組OD490值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，轉(zhuǎn)染48、72及96 h后，pcDNA3.1-LCPAT1組OD490值高于NC組及sh-LCPAT1組(P均<0.05)，見表1。

表1 三組細(xì)胞增殖能力比較

2.3 LncRNA LCPAT1對(duì)OS細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)示，pcDNA3.1-LCPAT1組細(xì)胞凋亡率為(4.1±0.4)%，NC組為(8.7±0.6)%，sh-LCPAT1組為(13.4±0.8)%，pcDNA3.1-LCPAT1組細(xì)胞凋亡率低于NC組及sh-LCPAT1組(P均<0.05)。

2.4 LncRNA LCPAT1對(duì)OS細(xì)胞侵襲的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-LCPAT1組侵襲細(xì)胞數(shù)為(354±19)個(gè)，NC組為(172±13)個(gè)，sh-LCPAT1組為(68±9)個(gè)，pcDNA3.1-LCPAT1組侵襲細(xì)胞數(shù)多于NC組(P<0.05)，sh-LCPAT1組侵襲細(xì)胞數(shù)少于NC組(P<0.05)。

2.5 LncRNA LCPAT1對(duì)OS EMT的影響 pcDNA3.1-LCPAT1組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC組(P<0.05),pcDNA3.1-LCPAT1組N-cadherin、Snail、Twist1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NC組(P均<0.05)。sh-LCPAT1組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NC組(P<0.05),sh-LCPAT1組N-cadherin、Snail、Twist1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC組(P均<0.05)，見表2。

表2 三組U-2OS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

在OS和癌旁組織中多種LncRNA分子存在差異性表達(dá)，且LncRNA能通過多種途徑參與OS的發(fā)生和進(jìn)展，可作為OS診斷、預(yù)后和治療的潛在分子標(biāo)志物[7-8]。最近研究[9]顯示，LncRNA TDRG1在OS組織中表達(dá)上調(diào)，在體外可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲過程，并通過激活癌細(xì)胞的PI3K/AKT 信號(hào)途徑而促進(jìn)OS進(jìn)展。ZHOU等[10]報(bào)道OS中LncRNA PVT1呈過表達(dá)，沉默LncRNA PVT1通過對(duì)miR-195發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡，并抑制OS細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲。SONG等[11]報(bào)道，LncRNA PVT1通過miR-497/HK2途徑參與糖代謝和OS細(xì)胞的增殖。

LncRNA LCPAT1是最新發(fā)現(xiàn)的LncRNA分子,其在腫瘤中的作用尚未進(jìn)行廣泛研究，目前僅在乳腺癌[6]患者中發(fā)現(xiàn)癌組織中LncRNA LCPAT1表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)與乳腺癌TNM分期、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的OS細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1表達(dá)較人正常成骨細(xì)胞系hFOB 1.19表達(dá)上調(diào)。文獻(xiàn)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1表達(dá)上調(diào)[5]，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)相符。在體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系功能試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LncRNA LCPAT1可能通過激活微纖維相關(guān)蛋白2基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程[6]。經(jīng)吸煙干預(yù)人正常肺上皮細(xì)胞系Beas-2B后，LncRNA LCPAT1可通過下調(diào)染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白2影響DNA雙鏈損傷修復(fù)過程，進(jìn)而影響染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[12]。在肺癌中，LncRNA LCPAT1在肺癌組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化程度呈負(fù)相關(guān)，在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)LncRNA LCPAT1表達(dá)，肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及自噬過程顯著被抑制，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，顯著抑制腫瘤增長[13]。

本研究通過體外培養(yǎng)OS細(xì)胞系(U-2OS細(xì)胞)中功能獲得和喪失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)OS細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1表達(dá)后，可促進(jìn)OS細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制OS細(xì)胞凋亡。反之，下調(diào)OS細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1表達(dá)后，可抑制OS細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡，上述結(jié)果提示LncRNA LCPAT1在OS細(xì)胞系中發(fā)揮癌基因作用。在OS中LncRNA LCPAT1高表達(dá)可通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲且抑制凋亡而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，進(jìn)而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。前期研究我們發(fā)現(xiàn)，LncRNA LCPAT1高表達(dá)與OS病情進(jìn)展及預(yù)后差相關(guān)。上述結(jié)果提示，通過抑制或下調(diào)OS組織中LncRNA LCPAT1表達(dá)可能為OS潛在的治療方式，其可能為OS潛在的治療靶點(diǎn)。

EMT被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的初始步驟，并且在癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[13-14]。在OS的發(fā)生和進(jìn)展過程中，EMT發(fā)揮重要作用,其調(diào)節(jié)涉及大量的基因、蛋白質(zhì)、LncRNAs和miRNAs調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[15]。最近研究顯示，在OS細(xì)胞系中LncRNA CRNDE高表達(dá)可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑促進(jìn)癌細(xì)胞EMT過程而影響OS患者預(yù)后[16]。同時(shí)研究顯示，OS中LncRNA PGM5-AS1可調(diào)節(jié)miR-140-5p-FBN1軸進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞EMT過程，導(dǎo)致OS預(yù)后不良[17]。本研究通過蛋白印跡發(fā)現(xiàn)上調(diào)LncRNA LCPAT1后，上皮間皮轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵蛋白E-cadherin表達(dá)降低，而N-cadherin﹑Snail﹑Twist1蛋白表達(dá)增加，提示EMT過程受到抑制。反之，下調(diào)LncRNA LCPAT1后，EMT過程中關(guān)鍵蛋白E-cadherin表達(dá)增加，而N-cadherin﹑Snail﹑Twist1蛋白表達(dá)降低，提示其能促進(jìn)EMT過程。本研究結(jié)果揭示LncRNA LCPAT1表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)EMT過程而促進(jìn)OS發(fā)生和進(jìn)展，加速OS細(xì)胞增殖和侵襲，抑制其凋亡，而導(dǎo)致其不良預(yù)后。

綜上所述，OS細(xì)胞系中LncRNA LCPAT1表達(dá)上調(diào)，LncRNA LCPAT1可調(diào)節(jié)OS細(xì)胞系增殖、侵襲、凋亡和EMT過程，LncRNA LCPAT1是OS潛在有希望的治療靶點(diǎn)。