劉洪蕾，甄思慧，王家偉，程如楠，岳 亮，王 真

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院/獸醫(yī)學(中獸醫(yī))北京市重點實驗室，北京 102206)

抗菌藥物在醫(yī)學和農(nóng)業(yè)領域的濫用導致了耐藥菌及耐藥基因(ARGs)的出現(xiàn)，并可在全球環(huán)境中檢測到抗菌藥物。尤其值得關注持續(xù)出現(xiàn)的“超級細菌”和無法治療的感染的現(xiàn)象。大腸埃希氏菌是人類和動物中最常見的革蘭氏陰性細菌。抗藥性大腸埃希氏菌的感染在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。根據(jù)國家衛(wèi)生與健康委員會細菌耐藥性調(diào)查網(wǎng)(Mohnarin)2015年公布的官方數(shù)據(jù)，大腸埃希氏菌的耐藥性排名最高[1]。近年來，由于大腸埃希氏菌抗菌藥物耐藥性的出現(xiàn)速度過快，缺乏針對高耐藥菌株的治療藥物，使抗菌藥物耐藥和大腸埃希氏菌感染問題受到了廣泛關注。此外，由于大腸埃希氏菌容易發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，常被認為是抗菌藥物耐藥性傳播的載體[2]。長期以來細菌耐藥性的傳播促使人們通過各種方法尋找新的抗菌藥物，如改變現(xiàn)有的抗菌藥物，通過篩選化學藥品[3-4]或肽庫[5-6]以尋找特定的抑制劑，或靶向新的蛋白質(zhì)并研究其作用[7-8]。近年研究還涉及通過基因組學檢測新的靶點[9]，利用生物信息學篩選肽類抗菌劑，以及通過宏基因組學尋找抗菌藥物新來源[10]。

早期對相關耐藥基因的篩選研究表明，大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)座子插入deoT基因(一種DeoR家族的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子DeoT的基因)會增加抗菌藥物的敏感性。DeoR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族的成員存在于多種革蘭氏陽性菌和陰性菌中[11]。據(jù)報道，DeoT作為一種調(diào)節(jié)因子還能影響其他不同調(diào)節(jié)子的多個無關基因的表達[11]。DeoR1被證明參與了布魯氏菌virB基因轉(zhuǎn)錄的激活[12]。此外，DeoT抑制參與不同代謝途徑的基因表達，包括糖的運輸、肽的降解和脂肪酸的分解；還可能與細胞對環(huán)境變化的反應有關[11]。正如在大腸埃希氏菌對滲透壓上調(diào)的早期反應中觀察到的一樣[13]，DeoT抑制基因的方式可能反映了代謝途徑的普遍下調(diào)，從而導致短暫的生長停滯。除上述報道外，DeoT是否參與了大腸埃希氏菌耐藥基因的調(diào)控尚不清楚。

為了進一步了解DeoT對大腸埃希氏菌基因表達的調(diào)控作用，并證實DeoT對大腸埃希氏菌耐藥性的影響，本研究構(gòu)建了deoT基因缺失株，對其轉(zhuǎn)錄組進行了測序分析，并通過熒光定量PCR(real-time PCR)對deoT調(diào)控靶向基因作用進行了確認。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用的大腸埃希氏菌E8親本株為本實驗室從河北省1頭腹瀉犢牛中分離得到的。藥敏試驗證實，該分離菌株E8對多種藥物具有耐藥性，尤其是對氨基糖苷類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。所有菌株在添加或不添加氨芐青霉素(100 mg/L)和氯霉素(30 mg/L)LB中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑及儀器 細菌RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；Agilent 2100生物分析儀，北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1deoT基因缺失突變體及互補菌株的構(gòu)建 為構(gòu)建deoT基因缺失株，如文獻所述進行基因消除[14]。引物如下：deoT-F(AGAGCGGATGATTTGTCAAACTGCAAATCATCCCGTAGAGAAGGGAAATGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG),deoT-R(CGCGTCAGTATTTTTTTATTTAGTATTATAACGTTATAAGAATTACAGCGCATATGAATATCCTCCTTAG)。為構(gòu)建E8ΔdeoT的基因互補株，將deoT片段擴增后連接到質(zhì)粒pBBR1MCS中。將得到的重組載體pBBRdeoT電穿孔到E8ΔdeoT中，命名為E8CdeoT。

1.2.2 抗菌藥物最小抑菌濃度測定 最小抑菌濃度(MIC)是指抑制細菌生長的抗菌藥物所需最低濃度。為探究deoT對大腸埃希氏菌抗菌藥物的敏感性，篩選出四環(huán)素、萬古霉素、新霉素、氨芐青霉素、青霉素、諾氟沙星、大觀霉素、頭孢唑肟、慶大霉素、萘啶酸等10種抗菌藥物。將菌株用LB培養(yǎng)基在37 ℃中培養(yǎng)過夜，調(diào)整活菌到106CFU/mL。在試管中用MH培養(yǎng)基分別將每種抗菌藥物從2 048 μg/mL進行2倍稀釋。隨后，將1 mL細菌懸液分別加入到每種抗菌藥物的不同濃度試管，充分混勻后在37 ℃下培養(yǎng)16 h～18 h。重復3組。

1.2.3 RNA的提取和測序 將菌株E8和E8ΔdeoT的單個菌落用LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h。用細菌RNA提取試劑盒分離每個樣品的總RNA。使用2100生物分析儀驗證RNA質(zhì)量，通過無RNA酶瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的RNA樣本用于cDNA文庫的構(gòu)建。cDNA文庫在Illumina測序平臺 (Illumina HiSeq 2000，Illumina，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國)上使用配對末端技術進行測序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析 以大腸埃希氏菌O157：H7基因組為參考序列，通過SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和sickle (https://github.com/najoshi/sickle)去除適配序列、低質(zhì)量讀數(shù)(Q值<20)、不明確的核苷酸“N”和長度小于20 bp的片段序列。以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR<0.05)和log2FC≥2作為閾值來判斷基因表達差異顯著性。用GO[15]和KEGG[16]對差異表達基因進行注釋和分類。

1.2.5 熒光定量PCR驗證 為了驗證RNA-seq的結(jié)果，對5個顯著上調(diào)和5個顯著下調(diào)的基因進行RT-qPCR。每個基因擴增用引物見表1。按照上述方法分離總RNA，然后根據(jù)(賽默飛世爾科技有限公司)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用Power SYBR Green PCR系統(tǒng)將1 μL所得cDNA進行qPCR。檢測基因的正、反引物如表1所示，用16S rRNA基因?qū)λ兄颠M行標準化。使用2-△Ct方法計算相對表達水平[17]，使用所有基因的平均Ct值進行分析以校正cDNA輸入的差異。

表1 RT-qPCR擴增所用引物

2 結(jié)果

2.1 突變株E8ΔdeoT對抗菌藥物的耐藥性

各菌株對抗菌藥物的MIC測定結(jié)果如表2所示，E8ΔdeoT對四環(huán)素(4倍)、萬古霉素(4倍)、萘啶酸(4倍)、氨芐青霉素(2倍)、大觀霉素(2倍)和青霉素(4倍)的敏感性高于親本菌株E8和互補菌株E8CdeoT。表明DeoT編碼基因的缺失影響了大腸埃希氏菌E8株固有的多重耐藥性。

表2 大腸埃希氏菌株的藥物敏感性

2.2 DeoT對大腸埃希氏菌基因的表達調(diào)控

為了解deoT基因的功能，使用RNA-seq分析法測定了deoT缺失株基因的轉(zhuǎn)錄組。從E8和E8ΔdeoT的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中分別獲得15234336和17645316個序列。將測序序列與大腸埃希氏菌O157:H7的基因組匹配。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)E8ΔdeoT與E8的差異表達基因共有118個，其中有76個基因表達下調(diào)，42個基因表達上調(diào)。

2.3 E8ΔdeoT差異表達基因的GO和KEGG分析

E8ΔdeoT差異表達基因的功能分類結(jié)果如圖1所示，所有與調(diào)節(jié)生物過程、信號轉(zhuǎn)導和受體活性相關的基因均上調(diào)；與生物黏附、細胞成分組織或生物轉(zhuǎn)化、抗氧化活性和電子載體活性相關的基因均下調(diào)。除這些功能分類外，所有其他類別均包括上調(diào)和下調(diào)基因。在與細胞代謝、單個生物過程、細胞或細胞成分和催化活性相關的基因中，下調(diào)基因的數(shù)量與上調(diào)基因的數(shù)量相似。KEGG分析表明，差異表達基因涉及代謝途徑，包括各種氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)和能量代謝等多個途徑。此外，還有多個基因涉及細胞膜轉(zhuǎn)運、雙組分系統(tǒng)和細菌趨化途徑等。并且這些途徑可能直接或間接地與大腸埃希氏菌耐藥性有關。

圖1 差異基因表達

2.4 DeoT對ABC轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)運/膜蛋白的調(diào)控

轉(zhuǎn)運蛋白通過參與化學物質(zhì)的吸收、分布和消除來影響其在細胞內(nèi)的分布。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，29個與ABC轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白和膜蛋白相關的基因在E8ΔdeoT中差異表達。如ABC轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因malE、dcuB、malK和mglB在E8ΔdeoT中的表達顯著降低。轉(zhuǎn)運蛋白/膜蛋白編碼基因，如tdcC、srlB、nanT、malG、rbsB、ompT、yeeE、fimD和galP下調(diào)，exbB、feoA、feoB、feoC、cysU、cysP、cysA、cysW和ydhC在E8ΔdeoT中顯著上調(diào)。研究報道發(fā)現(xiàn)由exbB編碼的生物聚合物轉(zhuǎn)運蛋白ExbB是幽門螺旋桿菌的關鍵藥物靶點[18]。一種在極端變性條件下具有活性的外膜蛋白酶OmpT能夠提高大腸埃希氏菌對正丁醇的耐受性[19]。 參與鐵轉(zhuǎn)運的FeoA也被發(fā)現(xiàn)顯著提高了對正丁醇-丁醇的抵抗力[19]。參與鐵轉(zhuǎn)運相關的基因在E8ΔdeoT中上調(diào)，表明鐵轉(zhuǎn)運途徑受到破壞。

2.5 DeoT對新陳代謝的調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄組分析表明，許多與代謝相關的基因在E8ΔdeoT中有差異表達，如fumB、aceE、aceF、sucB、sucD、mdh、pckA、sdhB、pflD、ttuC、gapA、yiaY、tdcD、garR、srlB、srlD、nanE、nanA、lacZ、frdD、frdC、frdB等參與碳水化合物代謝。4種frd基因編碼富馬酸還原酶復合物的亞基，該復合物轉(zhuǎn)錄組受交替電子受體氧、硝酸鹽和富馬酸的細胞可用性的調(diào)控。[24]。據(jù)報道，frdD突變可能影響ampC啟動子的強度，誘導ampC的表達增強，并導致大腸埃希氏菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐受性的增加[20]。從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果來看，frdD在E8ΔdeoT中的表達下調(diào)。

此外，11個涉及氨基酸代謝的基因包括tnaA、katG、cadA、cysK、cadB、sdaA、cysM、trpGD、trpE、katG、speC和ansA，在E8ΔdeoT中均有差異表達。例如，cadA和cadB在E8ΔdeoT中表達顯著上調(diào)；CadA是一種賴氨酸脫羧酶，可將賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺(一種多胺)。所有細胞類型的正常生長都需要多胺，它可以影響蛋白質(zhì)、DNA和RNA的功能。反轉(zhuǎn)運蛋白CadB吸收賴氨酸并排出尸胺，從而消耗質(zhì)子[21]。然而，許多作為二級轉(zhuǎn)運器的多藥外排系統(tǒng)是由跨膜電化學質(zhì)子梯度(ΔμH+)的質(zhì)子動力(PMF)驅(qū)動的，而不是由ATP水解驅(qū)動的[22]。因此，E8ΔdeoT中顯著上調(diào)的cadA和cadB基因?qū)е沦|(zhì)子減少，從而影響多藥外排系統(tǒng)的功能，提高E8ΔdeoT對大多數(shù)抗菌藥物的敏感性。

2.6 差異表達基因的RT-qPCR驗證

為了驗證RNA-seq分析的基因差異表達模式，選擇顯著差異調(diào)控的基因進行了RT-qPCR。在118個差異表達的基因中，根據(jù)基因功能及其在抗菌藥物耐藥性中的潛在作用選擇了10個基因。如表3所示，RNA-seq和RT-qPCR結(jié)果具有良好的一致性；在E8ΔdeoT中有5個基因下調(diào)，5個基因上調(diào)。由此證實了RNA-seq和RT-qPCR數(shù)據(jù)之間的強相關性，以及基因表達的真實性。

表3 選擇基因的RT-qPCR結(jié)果

3 討論

DeoT是DeoR家族的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于多種細菌中。DeoT作為一種廣譜調(diào)節(jié)因子，抑制多種代謝途徑中基因的表達，包括麥芽糖轉(zhuǎn)運、脂肪酸β-氧化和肽降解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌deoT基因缺失后對常用抗菌藥物的MIC明顯降低，表明DeoT在大腸埃希氏菌耐藥性中起重要作用。

對大腸埃希氏菌親本菌株E8和E8ΔdeoT突變體進行了轉(zhuǎn)錄組學分析。結(jié)果表明，在E8ΔdeoT中共鑒定出118個差異表達基因，其中76個下調(diào)基因和42個上調(diào)基因。其中，E8ΔdeoT的差異表達基因包括4個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和29個運輸/膜蛋白編碼基因。轉(zhuǎn)運蛋白通過參與化學物質(zhì)的吸收、分布和消除來影響其在細胞內(nèi)化學物質(zhì)的分布。多重耐藥(MDR)轉(zhuǎn)運蛋白主動外排抗菌藥物是引起細菌耐藥的主要途徑，使細菌感染的臨床治療復雜化[23]。例如，由exbB編碼的生物聚合物轉(zhuǎn)運蛋白ExbB被發(fā)現(xiàn)是幽門螺桿菌的關鍵藥物靶點[18]，且在E8ΔdeoT中出現(xiàn)顯著上調(diào)，極有可能增加了E8ΔdeoT藥物敏感性。

此外，RNA-seq結(jié)果顯示，許多與代謝相關的基因在E8ΔdeoT中差異表達；參與氨基酸代謝的cadA和cadB在E8ΔdeoT中顯著上調(diào)。此前已有報道稱，cadA和cadB也可以間接影響多藥外排系統(tǒng)的功能[21]，從而提高E8ΔdeoT對大多數(shù)抗菌藥物的敏感性。

綜上所述，DeoT在大腸埃希氏菌多重耐藥性中起著重要的作用，直接或間接調(diào)控多個基因的表達。本文為了解DeoT具體調(diào)控的相互作用以及與大腸埃希氏菌耐藥性的關系提供了重要信息，但仍需要進一步的研究來分析DeoT參與的細菌多重耐藥性調(diào)控機制。