李 娟，劉秋晨，李晶晶，林 洋，李志興，王 庭，劉 艷，2，單春喬*

(1.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司，遼寧大連 116036；2.江蘇三儀生物工程有限公司，江蘇邳州 221300)

鳀魚(Engraulisjaponicus)屬于鯡形目、鳀科(Engraulidae)、鳀屬(Engraulis)，是一種生活在溫帶海洋中上層的小型魚類，又名鳁抽條，海蜒，離水爛，老眼屎，鲅魚食，分布于北太平洋西部，我國廣泛分布于東海、黃海和渤海[1]。鳀魚是其他經(jīng)濟(jì)魚類的餌料生物，由于鳀魚個(gè)體小，易腐爛，不能長時(shí)間儲存，因此鳀魚是制作魚粉的優(yōu)質(zhì)原料[2]，而魚粉是水產(chǎn)和乳仔豬飼料優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白質(zhì)原料[3]。我國是既是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國[4]，也是飼料原料進(jìn)口和消耗大國[5]，飼料的安全與否對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展有著至關(guān)重要的影響。非洲豬瘟的暴發(fā)使人們意識到飼料及飼料原料是攜帶和傳播病原性細(xì)菌和病毒的重要載體。因此，鳀魚品質(zhì)的高低對凈化水產(chǎn)飼料具有重要意義，同時(shí)也會直接影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

本研究從冷凍的鳀魚中分離出1株細(xì)菌，并對其進(jìn)行細(xì)菌分離、形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16S rDNA基因序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對分離菌進(jìn)行鑒定，確定為摩氏摩根菌，同時(shí)采用Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法對分離菌株TY進(jìn)行耐藥性分析，以期得到對鳀魚中摩氏摩根菌有效的抗菌藥物，為實(shí)際應(yīng)用提供有效的解決辦法，同時(shí)也為實(shí)際生產(chǎn)中預(yù)防致病性病原菌來源提供可參考的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 冷凍鳀魚10 kg，遼寧省葫蘆島某魚粉廠提供。

1.1.2 主要試劑 亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；TaqPlus DNA 聚合酶 、10×PCR buffer(含Mg2+)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Ladder Mix Maker、引物、Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 3 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；恒溫?fù)u床，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋，廈門致徽儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR儀、凝膠成像儀，美國伯樂產(chǎn)品；電泳儀 、穩(wěn)壓電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察 隨機(jī)挑選25條鳀魚，無菌采集鳀魚的腮、腸道磨碎加入裝有緩沖蛋白胨水(BPW)培養(yǎng)基無菌錐形瓶內(nèi)增菌，37 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±1h，用接種環(huán)取1環(huán)增菌液接種到亞硫酸鉍瓊脂(BS)培養(yǎng)基上，37 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±1 h，將單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。并挑取可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±1 h進(jìn)行分離純化，觀察細(xì)菌生長情況及菌落特征。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 將純化后的菌落無菌接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中，按其要求進(jìn)行培養(yǎng)觀察，并參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》判定結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增和測序 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的基因，用 16S rDNA通用引物，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。引物序列為:上游引物: 5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；下游引物:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；25 μL 擴(kuò)增體系：25 Template(基因組DNA 20 ng/μL～50 ng/μL)0.5 μL，10×buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，酶0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃ 終止反應(yīng)20 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行點(diǎn)樣。用DNA分子量標(biāo)記物做參照。150 V、100 mA 電泳20 min，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析 將所測序列提到交GenBank，利用Blast對所測序列與GenBank上收錄的16S rDNA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性搜索。采用Mega6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法對已分離的摩氏摩根菌進(jìn)行常用抗菌藥物的敏感性檢測，并根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI/NCCSL)LY2014執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定摩氏摩根菌對藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)中所用的9種抗菌藥物包括頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢拉定、鏈霉素、新霉素、阿奇霉素、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征

分離菌株在BS培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)48 h，菌落呈淺綠色，圓形，凸起。革蘭氏染色陰性菌，短桿狀，兩端鈍圓。純化后在營養(yǎng)瓊脂上生長良好，菌落呈乳白色，表面光滑，凸起，圓形。將該菌株命名為TY。

2.2 生化鑒定

分離菌株TY生化鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，葡萄糖發(fā)酵、運(yùn)動(dòng)性、鳥氨酸、氰化鉀為陽性；麥芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫化氫、山梨醇、蛋白胨為陰性，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，分離菌株TY初步鑒定為摩氏摩根菌。

表1 分菌菌株TY生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rDNA鑒定

分離菌株TY所擴(kuò)增的16S rDNA基因序列長度為1 475 bp，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。通過NCBI的Blast系統(tǒng)進(jìn)行檢索，選擇同源性較高的序列，采用Mega6.0繪制成進(jìn)化樹。結(jié)果表明，該菌株TY與摩氏摩根菌的16S rDNA 基因序列自然聚為一支，結(jié)果見圖2。通過16S rDNA序列鑒定進(jìn)一步確定分離菌株TY為摩氏摩根菌。

圖2 菌株TY 16 S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 3 000;1.菌株TY

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株TY對頭孢哌酮、頭孢他啶、 鏈霉素、恩諾沙星、新霉素敏感，對頭孢氨芐、阿奇霉素、頭孢拉定、強(qiáng)力霉素表現(xiàn)耐藥。結(jié)果見表2。

表2 分離菌株TY藥敏性

3 討論

細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中最常見、危害最大的一類傳染性疾病，在魚類和兩棲類中均分離到多種致病菌[6]。摩氏摩根菌(M.morganii)是革蘭氏陰性菌，形態(tài)及生化反應(yīng)特征均與變形桿菌相似，但無遷徙現(xiàn)象。摩氏摩根菌是條件致病菌，是人畜魚共患致病菌，是醫(yī)源性感染的重要病原菌之一，可致人的各種感染，包括泌尿道感染和膿腫等[7]；在水產(chǎn)動(dòng)物方面，能導(dǎo)致錦鯉出現(xiàn)潰爛、口腔和腸道出血、充血[8]，大鯢[9]、中華鱉[10]、黃喉擬水龜頭肢潰爛[11]，能造成中國臺灣泥鰍死亡[12]，在患病鱸魚體內(nèi)分離出了摩氏摩根菌[13]；在畜禽方面，有報(bào)道稱摩氏摩根菌能導(dǎo)致肉雞發(fā)生機(jī)會性感染而導(dǎo)致死亡[13]，從健康黑山羊上呼吸道分離到對小鼠具有較強(qiáng)致病性的摩氏摩根菌[14]，從新鮮的雞蛋中也分離出了摩氏摩根菌[15]。但是目前尚未有關(guān)于從鳀魚中分離出的摩氏摩根菌的報(bào)道，本研究通過傳統(tǒng)生化鑒定方法結(jié)合。16 S rDNA菌種鑒定的方法從水產(chǎn)飼料原料鳀魚中分離出1株摩氏摩根菌TY。

2019年，國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號公告，自2020年1月1日起，我國飼料中全面禁止添加促生長類抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護(hù)動(dòng)物源食品安全和公共衛(wèi)生安全。但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對于致病菌防治與治療，仍然以抗菌藥物為主[16]。持續(xù)使用一定劑量有效的抗菌藥物后，會出現(xiàn)藥效減弱或完全消失的現(xiàn)象，這是因?yàn)椴≡鷮咕幬锂a(chǎn)生了抗性或耐藥性，即產(chǎn)生了耐藥菌株[17]。耐藥菌株的產(chǎn)生使得生產(chǎn)上用藥量越來越大，藥效越來越差，既增加了生產(chǎn)成本，又增加了防治難度。本試驗(yàn)中所篩選的摩氏摩根菌對第一代頭孢菌素頭孢氨芐、頭孢拉定，大環(huán)內(nèi)酯類阿奇霉素，四環(huán)素類強(qiáng)力霉素表現(xiàn)耐藥；對第三代頭孢菌素類頭孢哌酮、頭孢他啶，氨基糖苷類鏈霉素、新霉素，喹諾酮類恩諾沙星表現(xiàn)敏感。雖然作為飼料原料是不得檢出沙門氏菌、志賀氏菌以及其他致病菌，但是也不能排除其作為細(xì)菌或者病毒載體的可能性。

綜上所述，本研究從魚粉原料鳀魚中分離出的1株摩氏摩根菌，并對其進(jìn)行了耐藥性分析。這為飼料原料中病原菌的分離提供了理論依據(jù)，有一定的參考價(jià)值。同時(shí)，在水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖過程中，對于致病菌來源提供了可參考的方向。