丁繁萍，黃躍杰，魚?，|，馬紓薏，孟凡艷，石長青，胡建軍*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆阿拉爾 843300)

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病，是棘球絳蟲的中絳期棘球蚴感染所致，牛、羊、人等為中間宿主，狗、豹、鬣狗等為終末宿主，棘球蚴主要寄生于肝、肺等器官[1]。在分類上屬于帶科棘球?qū)?。棘球?qū)侔?個(gè)種，即細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)、多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)、石渠棘球絳蟲(Echinococcusshiqucus)、少節(jié)棘球絳蟲(Echinococcusoligarthrus)和福氏棘球絳蟲(Echinococcusvogeli)，我國以前3個(gè)種較為多見，其中對(duì)人畜危害最嚴(yán)重的為細(xì)粒棘球絳蟲[2]。細(xì)頸囊尾蚴(Cysticercustenuicollis)俗稱水鈴鐺，是泡狀帶絳蟲的中絳期，綿羊、豬是其中間宿主，在牛和其他野生反芻動(dòng)物的肝臟、腸系膜及其他器官中有時(shí)可見，感染嚴(yán)重時(shí)還會(huì)寄生于腎臟等器官[3-4]。

棘球蚴具有不同的基因型，且形態(tài)學(xué)分類方法不統(tǒng)一，為棘球蚴基因型鑒定帶來了困難[5-6]。棘球蚴線粒體基因組中編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ基因(COI基因)和NADH脫氫酶Ⅰ基因(NDI基因)的差異常用于線粒體基因型的變化程度研究[7-8]；細(xì)頸囊尾蚴的Cytb基因進(jìn)化速度適中，適用于種內(nèi)到科間甚至于科間的系列進(jìn)化關(guān)系、種群水平的研究[9]。本研究以傳統(tǒng)分類學(xué)為基礎(chǔ)，采用棘球蚴COI基因、NDI基因和細(xì)頸囊尾蚴Cytb基因進(jìn)行分子生物學(xué)基因分型鑒定，為包蟲病的分子流行病學(xué)和遺傳演化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 新疆南疆某羊場部分羊只出現(xiàn)消瘦、精神萎靡不振。剖檢可觀察肝臟有大小不等的棘球蚴囊泡；肝臟、腸系膜上有雞蛋大小的細(xì)頸囊尾蚴囊泡黏附。采集棘球蚴囊泡、細(xì)頸囊尾蚴囊泡保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器設(shè)備 旋渦混合器，三孔三溫水浴鍋，單道微量移液器，超凈工作臺(tái)，電泳儀，凝膠成像儀。

1.1.3 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)檢查 剝離肝臟上棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴囊泡置于潔凈的平皿，無菌注射器抽取囊泡中囊液，滴加于載玻片，鏡檢。

1.2.2 樣本總DNA提取 參照“血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒”說明書，提取棘球絳蟲、細(xì)頸囊尾蚴蟲體組織總DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[10-11]中棘球蚴基因分型特異性引物COI基因引物(COI-F、COI-R)和NDI基因引物(NDI-F、NDI-R)、細(xì)頸囊尾蚴基因分型特異性引物Cytb基因引物(Cytb 1、Cytb 2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.4 參考序列 文中涉及的棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴參考株基因序列均下載于NCBI中GenBank。

1.2.5 PCR反應(yīng) 棘球蚴COI、NDI基因PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。細(xì)頸囊尾蚴Cytb基因PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物Cytb 1和Cytb 2各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。分別取上述5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 PCR產(chǎn)物純化回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠，按照TIAN gel Midi Purification Kit試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.7 序列分析 測序結(jié)果在NCBI中Blast比對(duì)，DNA Star軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析；MEGA 5.0軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢

剖檢可見患羊肝臟表面凹凸不平，表面均有大小不等的棘球蚴囊泡突起，囊泡液呈淡黃色，囊壁分兩層(角質(zhì)層和生發(fā)層)；此外在肝臟、腸系膜上附有雞蛋大小的細(xì)頸囊尾蚴囊泡，泡內(nèi)充滿透明囊液。

2.2 鏡檢

顯微鏡下觀察可見囊液中原頭蚴上有小鉤吸盤，可見內(nèi)嵌頭節(jié)、外翻頭節(jié)。

2.3 COI、NDI、Cytb基因PCR擴(kuò)增

以棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴蟲體組織DNA為模板，棘球蚴特異性引物(COI-F、COI-R和NDI-F、NDI-R)，細(xì)頸囊尾蚴特異性引物(Cytb1/Cytb2)，分別擴(kuò)增出285、510、1 086 bp大小的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.棘球蚴COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3.棘球蚴NDI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;4.細(xì)頸囊尾蚴Cytb 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 棘球蚴COI、NDI基因核苷酸同源性比較

文中棘球蚴樣本分離株命名為GBC，以棘球蚴COI、NDI基因引物(COI-F/COI-R)、(NDI-F/NDI-R)，PCR擴(kuò)增、測序后在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，與棘球蚴參考株核苷酸序列同源性分別可達(dá)97%、99%以上(圖2和圖3)。

圖2 棘球蚴COI基因核苷酸同源性比較

圖3 棘球蚴NDI基因核苷酸同源性比較

運(yùn)用DNA Star對(duì)棘球蚴COI基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較；MEGA 5.0軟件用鄰近法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建棘球蚴COI基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)

圖4 以棘球蚴COI基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 細(xì)頸囊尾蚴Cytb基因核苷酸同源性比較

將細(xì)頸囊尾蚴樣本命名為XJNWY，與參考株進(jìn)行核苷酸同源性比較，運(yùn)用MEGA 5.0軟件采用鄰近法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，該序列與參考株肯尼亞/獅子(AB905198.1)、湖南/豬(FJ518620.1)、甘肅/羊(GQ228819.1)、攀枝花/山羊(JF720928.1)及中國/山羊(KT258035.1)位于同一進(jìn)化分支上，序列間核苷酸同源性較高(90.9%～99.5%)；而與細(xì)頸囊尾蚴參考株芬蘭/豬(AB731727.1)、土耳其/羊(KU925396.1)、意大利/牛(KU925423.1)、希臘/羊(KU925430.1)、墨西哥/豬(KX039965.1)、西班牙/羊(KY766903.1)及土耳其/牛(KY766904.1)同源性較低(74.6%～75.0%)(圖5和圖6)。

圖5 細(xì)頸囊尾蚴Cytb基因核苷酸同源性比較

圖6 細(xì)頸囊尾蚴Cytb基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

棘球蚴病嚴(yán)重危害人畜健康，世界性分布，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。利用分子生物學(xué)技術(shù)，分析棘球蚴各地理株間DNA序列差異，可將其分為10個(gè)基因型，包括Gl/羊株(Common sheep strain)、G2/塔斯馬尼亞羊株(Tasmanian sheep strain)、G3/水牛株(Buffalo strain)、馬株(Horse strain / G4)、牛株(Ordeppi strain / G5) 、駱駝株(Camel strain / G6)、豬株(Pig strain / G7)、鹿株(Cervid strain / G8)、波蘭株(Polish strain/G9)及麋鹿株(Fennoscandian cevid strain / G10)。其中，G1基因型在世界大部分地區(qū)流行[9]。

我國20多個(gè)省區(qū)均有棘球蚴感染的相關(guān)報(bào)道，新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、青海、四川等地為高發(fā)區(qū)，占全國范圍的87%[12]。新疆地區(qū)棘球蚴常見為G1基因型，其中Meng Q L等[13]報(bào)道新疆羊的感染率為9.8%。此外，Guo B P等[12]首次報(bào)道了新疆羊群中存在棘球G3基因型感染。在本研究中，所采樣本被鑒定為細(xì)粒棘球蚴G1基因型。

本研究中，細(xì)頸囊尾蚴XJNWY與參考株湖南/豬(FJ518620.1)、甘肅/羊(GQ228819.1)、攀枝花/山羊(JF720928.1)及中國/山羊(KT258035.1)的核苷酸同源性高(90.9%～99.5%)，說明它們種群間遺傳差異較?。欢c部分國外的細(xì)頸囊尾蚴參考株芬蘭/豬(AB731727.1)、土耳其/羊(KU925396.1)、意大利/牛(KU925423.1)、希臘/羊(KU925430.1)、墨西哥/豬(KX039965.1)、西班牙/羊(KY766903.1)及土耳其/牛(KY766904.1)同源性較低，僅有74.6%～75.0%。說明相鄰地區(qū)之間的同源性較相隔較遠(yuǎn)地區(qū)之間的分離株同源性較高。

棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴的宿主眾多，從形態(tài)學(xué)上分類，生物表型易受到外界環(huán)境的影響，同種不同分離株，在生物學(xué)特征方面存在著一定的差異[14]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因水平比較分析同一物種不同分離株的差異，有助于對(duì)寄生蟲的分類、種和株的分子鑒定和遺傳演化的研究。

本研究樣本數(shù)量有限，新疆南疆地區(qū)家畜棘球蚴和細(xì)頸囊尾蚴其他基因型混合感染情況有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)分離自新疆南疆某規(guī)模羊場的棘球蚴、細(xì)頸囊尾蚴進(jìn)行基因測序并分析，其結(jié)果顯示該病例為羊棘球蚴G1基因型和細(xì)頸囊尾蚴的混合感染。