張 峰，王正榮，蔣建軍，薄新文，張艷艷，賈春英

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000 ；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆圖木舒克 843901)

梨形蟲(chóng)病(Piroplasmosis)是一類(lèi)經(jīng)硬蜱傳播，由巴貝斯屬(Babesia)和泰勒屬(Theileria)原蟲(chóng)所引起的血液原蟲(chóng)病的總稱(chēng)[1]，主要引起宿主貧血消瘦、黃疸高熱、血紅蛋白尿等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致宿主的死亡[2]。梨形蟲(chóng)種類(lèi)繁多，迄今為止，全球范圍內(nèi)所記載的各種哺乳動(dòng)物的巴貝斯蟲(chóng)有67種[3]，泰勒蟲(chóng)有13種[4]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，蜱及蜱傳原蟲(chóng)病每年對(duì)畜牧業(yè)造成約70億美元的經(jīng)濟(jì)損失。及早地發(fā)現(xiàn)、確診是有效防控該病的關(guān)鍵，目前最為簡(jiǎn)單的臨床診斷方法為血涂片(或淋巴結(jié)穿刺)鏡檢，但無(wú)法準(zhǔn)確鑒定不同蟲(chóng)種，且靈敏度較低。血清學(xué)診斷方法雖然靈敏度、特異性較高，但不一定能證明寄生蟲(chóng)感染的存在，也不一定能證明保護(hù)性免疫的存在，因?yàn)槌３霈F(xiàn)不同蟲(chóng)種的交叉反應(yīng)，造成大量的假陽(yáng)性[5-6]。近些年來(lái)，PCR技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟，用以檢測(cè)血液中梨形蟲(chóng)DNA的分子方法具有較高的靈敏度和特異性，已被證明是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。本研究旨在調(diào)查小海子墾區(qū)牛梨形蟲(chóng)具體病原種類(lèi)，以采集牛血液樣本作為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR技術(shù)揭示該區(qū)域梨形蟲(chóng)種群分布，形成該區(qū)潛在或外來(lái)入侵病原對(duì)人畜健康、公共衛(wèi)生安全的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)警報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年5月至2020年11月在新疆小海子墾區(qū)7個(gè)采樣點(diǎn)(紅旗農(nóng)場(chǎng)、東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)、葉城牧場(chǎng)、伽師總場(chǎng)、44團(tuán)、45團(tuán)、51團(tuán))共采集?？鼓?68份，使用一次性靜脈采血針和EDTA抗凝管采集動(dòng)物頸靜脈血，帶回實(shí)驗(yàn)室放置-20 ℃冰箱進(jìn)行冷凍保存，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.1.2 主要儀器與試劑 梯度PCR儀，賽默飛公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；血液/細(xì)胞/組織基因組DAN提取試劑盒，天根(TIANGEN)生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取200 μL抗凝血置于1.5 mL PE管中，并按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)提取DNA。

1.2.2 牛梨形蟲(chóng)18S rRNA基因擴(kuò)增 引物參考已發(fā)表的巴貝斯蟲(chóng)和泰勒蟲(chóng)18S rRNA特異性引物[7-8](表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。巴貝斯蟲(chóng)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。泰勒蟲(chóng)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。最后取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序列及目的片段長(zhǎng)度

1.2.3 序列測(cè)定與分析 將PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，通過(guò)Blast進(jìn)行基因的同源序列對(duì)比。應(yīng)用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，最后利用MEGA7軟件，使用鄰接法(Neighbor-joinning)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其自展值檢驗(yàn)(Bootstrap test)為1 000。

2 結(jié)果

2.1 牛梨形蟲(chóng)不同地區(qū)檢測(cè)結(jié)果

使用巴貝斯蟲(chóng)和泰勒蟲(chóng)特異性引物對(duì)于小海子墾區(qū)568份牛血樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，共檢測(cè)出44份陽(yáng)性樣品，總陽(yáng)性率在7.75%。其中45團(tuán)的牛感染率較高，約14.58%；葉城牧場(chǎng)與53團(tuán)的牛感染率較低，均在5%以下；46團(tuán)的牛未發(fā)現(xiàn)梨形蟲(chóng)。不同地區(qū)牛梨形蟲(chóng)檢測(cè)率見(jiàn)表2。

表2 小海子墾區(qū)各地區(qū)牛泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 牛梨形蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

在568份牛血樣中，共檢測(cè)出44份陽(yáng)性樣品。將44份陽(yáng)性樣品全部送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果顯示,其中42份為環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)，其余2份為東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)。經(jīng)15 g/L凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示,泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性條帶約1 530 bp。凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 牛梨形蟲(chóng)序列分析

隨機(jī)挑選測(cè)序成功的樣本，與GenBank中已經(jīng)注冊(cè)的牛梨形蟲(chóng)18S rRNA序列進(jìn)行比較，檢出的2種泰勒蟲(chóng)與GenBank上已發(fā)表的泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)種序列的同源性均大于97%。以牛巴貝斯蟲(chóng)未定種新疆株(Babesiasp.Xinjiang，XM029015910)作為外類(lèi)群，使用MEGA 7軟件，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)定的環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲(chóng)意大利株(GenBank登錄號(hào)：MT341858)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)喀什株(GenBank登錄號(hào)：MK415058)的同源性均為100%。測(cè)定的東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)與東方泰勒蟲(chóng)東北株(GenBank登錄號(hào)：HM538201)、東方泰勒蟲(chóng)巴基斯坦株(GenBank登錄號(hào)：MG599096)的同源性均為99%。2種泰勒蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2和圖3。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～5.陽(yáng)性樣本; 6.陽(yáng)性對(duì)照; 7.陰性對(duì)照

圖2 基于環(huán)形泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 基于東方泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

小海子墾區(qū)位于新疆葉爾羌河流域下游，地處塔克拉瑪干沙漠西北邊緣，屬于暖溫帶大陸性干旱氣候。小海子墾區(qū)作為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第3師三大墾區(qū)之一，養(yǎng)殖業(yè)為其主要基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)，也是重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源，主要飼養(yǎng)牛、羊等家畜。因其獨(dú)特的地理氣候以及豐富的宿主資源，為牛梨形蟲(chóng)的生存提供了適宜的環(huán)境。

通過(guò)對(duì)于牛血樣進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)、東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)，且環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)為優(yōu)勢(shì)種，但并未發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲(chóng)。本文所發(fā)現(xiàn)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲(chóng)意大利株(GenBank登錄號(hào)：MT341858)的同源性為100%，這與王冰潔[9]在吐魯番地區(qū)所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同。此外，本文所發(fā)現(xiàn)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲(chóng)喀什株(GenBank登錄號(hào)：MK415058)的同源性也為100%，造成這種結(jié)果的原因可能是由于小海子墾區(qū)與喀什相鄰，兩地牲畜頻繁交易。簡(jiǎn)子健等[10]在2006年-2008年曾對(duì)全疆14個(gè)地、州、市進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)是新疆牛梨形蟲(chóng)病的主要病原，感染率居高不下(>11%)，遍及各個(gè)州市，也確定了環(huán)形泰勒蟲(chóng)(T.annulata)在新疆地區(qū)為優(yōu)勢(shì)種。自1930年在俄羅斯發(fā)現(xiàn)東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)以來(lái)，澳大利亞、日本、韓國(guó)、越南、印度等地都有相關(guān)的報(bào)道。在我國(guó)，東方泰勒蟲(chóng)主要存在于吉林、遼寧、甘肅、河南、河北、湖南、貴州等地。本文所發(fā)現(xiàn)的東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)與東方泰勒蟲(chóng)東北株(GenBank登錄號(hào)：HM538201)、東方泰勒蟲(chóng)巴基斯坦株(GenBank登錄號(hào)：MG599096)的同源性均為99%，證明了新疆地區(qū)也存在東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)。但目前新疆地區(qū)有關(guān)東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)的報(bào)道較少，對(duì)于新疆地區(qū)東方泰勒蟲(chóng)(T.orientalis)的研究有待深入。

綜上所述，本文對(duì)新疆小海子墾區(qū)牛梨形蟲(chóng)的感染情況和感染蟲(chóng)種進(jìn)行了調(diào)查，提供了分子依據(jù)，為摸清小海子墾區(qū)牛梨形蟲(chóng)病基線(xiàn)提供了技術(shù)支撐。