王吉宇，李成文，徐彥靖，于 青，劉 楠，劉東春,

（1.沈陽藥科大學中藥學院, 遼寧沈陽 110016；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016）

藏紅花素是類胡蘿卜素類二萜類化合物，為藏紅花酸與β-D-葡萄糖或龍膽二糖形成的糖苷，是藏紅花中的重要活性成分[1?2]。藏紅花素和藏紅花酸在抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、增強記憶、抗抑郁[3]、改善視力[4]等方面均顯示出較好的藥效。藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素口服幾乎不能直接吸收進入血液循環(huán)[5]，只有被腸道微生物水解為藏紅花酸后才能被吸收進入血液循環(huán)[6?7]，個體的腸道菌群差異會導致藏紅花素的藥效不穩(wěn)定。并且相對于藏紅花素，藏紅花酸在體內(nèi)與白蛋白結(jié)合較弱，可較迅速分布于各組織中，透過血腦屏障能力也有所提高，療效增加[8?9]。其中反式藏紅花酸在治療抑郁[10]、帕金森癥和阿爾茲海默癥[11?12]等神經(jīng)疾病方面顯示出明顯療效。因此大量制備高純度的反式藏紅花酸將為其新藥的研究與開發(fā)奠定基礎。

藏紅花素是藏紅花酸與糖的端羥基形成的酯（圖1），既有酯鍵又有糖苷鍵的特征[13]，所以可以采用堿水解、酸水解和酶解的方法水解藏紅花素制備藏紅花酸。Tashakori等[14]采用的酸水解法存在藏紅花素的水解不充分的問題，Chai等[15]采用的酶解法不僅僅對于酶的種類、用量要求高而且步驟繁瑣。而Esposito等[16]采用堿水解法，可便捷地完成藏紅花素的水解，是制備反式藏紅花酸有效的方法。但是反式藏紅花酸容易被氧化并且會發(fā)生構(gòu)象的轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)化為順式藏紅花酸導致反式藏紅花酸的含量降低，進而降低療效[17]。堿的濃度、溫度、反應時間等因素均可能影響產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度，因此有必要對方法進行優(yōu)化。

圖1 西紅花苷Ⅰ(A)、西紅花苷Ⅱ（B）與反式藏紅花酸（C）、順式藏紅花酸（D）的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of crocinⅠ(A), crocinⅡ(B), cis-crocetin(C), and trans-crocetin(D)

本研究首先采用單因素考察堿的濃度、溫度、水解反應時間三個因素對產(chǎn)物反式藏紅花酸的產(chǎn)率的影響，進一步采用響應面法優(yōu)化制備參數(shù)，反式藏紅花酸粗品經(jīng)過重結(jié)晶工藝進一步制取高純度的全反式藏紅花酸，旨在為藏紅花酸的進一步開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏紅花素(純度25%，w/w) 實驗室自制；反式藏紅花酸標準品（≥98.0 %）、西紅花苷-I標準品（≥98.0 %） 上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇 色譜純，天津大茂化學試劑公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇 分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

2695-2487 UV高效液相色譜系統(tǒng)美國 Waters公司；ESJ182-4精密天平 沈陽龍騰電子有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠；SB-3200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；MX-S混勻儀 美國SCILOGEX公司；CT14RD高速臺式冷凍離心機 上海精科天美有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；Ni-u 正置顯微鏡 日本尼康株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 水解工藝 將實驗室自制的藏紅花素配制成10.0 mg/mL的溶液，加入適量的氫氧化鈉（濃度為0.1 mol/L）溶液，在水浴中按規(guī)定溫度和時間進行水解反應，反應結(jié)束后放冷至室溫，加入0.1 mol/L鹽酸調(diào)整pH至2~3，使藏紅花酸沉淀析出，8000 r/min離心10 min，沉淀用適量純水洗至中性，收集沉淀，減壓冷凍干燥即得藏紅花酸粗品[18]。

1.2.2 極端反應條件對反式和順式藏紅花酸產(chǎn)率的影響 精密量取10.0 mg/mL藏紅花素溶液20.0 mL，加入0.7 mL氫氧化鈉溶液（1.0 mol/L）使堿濃度為1.4 mg/mL，平均分成4份平行樣品，在80 ℃水解1、3、5和7 h后，取1 mL水解樣品按照1.2.1方法處理，得到反式藏紅花酸粗品并經(jīng)HPLC檢測，觀察產(chǎn)物中順式、反式藏紅花酸產(chǎn)率的變化。

1.2.3 單因素實驗 取10 mg/mL的藏紅花素溶液1 mL，按照1.2.1中的方法進行水解，反式藏紅花酸的產(chǎn)率作為評價指標。固定氫氧化鈉濃度1.4 mg/mL、反應溫度70 ℃或反應時間1 h，分別考察氫氧化鈉濃度（1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）、反應時間（15、30、60、90、120 min）、反應溫度（50、60、70、80和90 ℃）的影響，每組實驗重復3次。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎上，選取反應時間（A）、溫度（B）和氫氧化鈉濃度（C）為考察因素，以反式藏紅花酸的產(chǎn)率(Y)作為響應值，采用實驗設計與統(tǒng)計軟件JMP 14進行Box-Behnken響應面試驗設計，響應面試驗因素與水平設計見表1[19?20]。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 藏紅花酸產(chǎn)率的計算

1.2.5.1 高效液相色譜條件 根據(jù)參考文獻[21]并作適當調(diào)整，色譜柱：Inertsil ODS-3液相色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：A 為甲醇（含有0.5%乙酸），B為水（含有0.5%乙酸）；梯度洗脫程序：0~6 min，55%A→55%A；6~12 min，55%A→90%A；12~25 min，90%A→90%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：423 nm。

1.2.5.2 反式藏紅花酸的含量測定及產(chǎn)率的計算精密吸取溶劑DMF1.00 mL溶解全部水解產(chǎn)物，再精密移取上述溶液100 μL置于10 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。使用反式藏紅花酸標準品配制成為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和 50.0 μg/mL 的溶液，在濃度2.5~50.0 μg/mL范圍內(nèi)色譜峰面積（A）與藏紅花酸的濃度（C）的線性關系良好，標準曲線為A=7.448×104C-1.035×104（r=0.9991）。

產(chǎn)率計算方法如公式1所示：

式中：Y（%）表示反式藏紅花酸的產(chǎn)率；C表示稀釋后的反式藏紅花酸的濃度，mg/mL；W表示理論上藏紅花酸的量(藏紅花素含量以25%計，HPLC法)，mg；V表示進樣體積，mL；n表示藏紅花酸的稀釋倍數(shù)。

1.2.5.3 順式藏紅花酸相對含量的計算 由于順式藏紅花酸與反式藏紅花酸吸光度相近，因此本研究（參照1.2.5.2項下）采用反式藏紅花酸的標準曲線計算順式藏紅花酸產(chǎn)率，結(jié)果不影響實驗參數(shù)的優(yōu)化[22]。

1.2.6 反式藏紅花酸的純化 將反式藏紅花酸粗品用0.003 mol/L NaOH溶液溶解，過濾，用0.001 mol/L HCl將溶液pH調(diào)節(jié)至7~8[23]，靜置于避光、干燥、陰涼處，將得到的沉淀進一步用氫氧化鈉溶液溶解，然后用HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2~3，待反式藏紅花酸結(jié)晶析出后過濾，純水洗滌2次，減壓干燥得到反式藏紅花酸結(jié)晶。

1.2.7 反式藏紅花酸結(jié)晶的形態(tài)學觀察 用解剖針挑取純化后的反式藏紅花酸晶體微量置于載玻片上，滴加液體石蠟適量，蓋上蓋玻片后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 反式藏紅花酸的結(jié)構(gòu)鑒定 將純化后的冷凍干燥樣品溶于 DMSO-d6（濃度 8.0 mg/mL），采用Bruker AVANCE Ⅲ HD核磁共振波譜儀測定(1H為 600 MHz，13C為 151 MHz)，溶劑信號為(DMSO-d6, 2.50 ppm,1H; 39.52 ppm,13C)[24]。使用MestReNova（V14）軟件進行圖譜處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2016 和GraphPadprism 6軟件對數(shù)據(jù)進行處理及繪圖；響應面試驗運用JMP 14.0軟件進行分析和設計。所有實驗平行測定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜結(jié)果

高效液相色譜圖如圖2所示，藏紅花素原料中的藏紅花素水溶性良好，因此在5.74 min時出峰，并且由于藏紅花素中連接著不同的糖，因此在后面存在一些其他藏紅花素峰。藏紅花素水解后，藏紅花酸極性小，保留時間變長，反式藏紅花酸和順式藏紅花酸分別于17.01 min和18.92 min出峰，這與Chilakala等[22]的研究結(jié)果相似。

圖2 各樣品HPLC圖譜Fig.2 Representative HPLC chromatograms of samples

2.2 極端反應條件對藏紅花酸順式和反式產(chǎn)率的影響

在長時間高溫水解制備過程中，反式和順式藏紅花酸的產(chǎn)率變化如圖3所示。1~7 h內(nèi)隨著水解時間的增加，反式藏紅花酸的產(chǎn)率有下降趨勢，從85.19%逐步減至74.50%。長時間的高溫下，反式藏紅花酸會受熱氧化降解，生成4-羥基-2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-甲醛和 4,5,6,7-四氫-7,7-二甲基-5-氧代-3 H-異苯并呋喃酮[25]。順式藏紅花酸產(chǎn)量略有提高，從15.31%增至16.28%，是因為反式藏紅花酸會發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變生成順式藏紅花酸[26?27]。

圖3 藏紅花素堿水解中順式和反式藏紅花酸產(chǎn)率隨時間的變化Fig.3 Production of cis-crocetin and trans-crocetin in crocetin alkali hydrolysis

2.3 單因素實驗

2.3.1 氫氧化鈉濃度的影響 由圖4可看出，反式藏紅花酸的產(chǎn)率隨著氫氧化鈉濃度的增加先上升后維持一定水平稍有下降。在1.4~1.6 mg/mL氫氧化鈉濃度范圍內(nèi)，反式藏紅花酸的產(chǎn)率達到最高值78.41%~78.42%。然而堿濃度過高，反式藏紅花酸中存在的長鏈共軛雙鍵對pH比較敏感，強堿性下會發(fā)生降解及構(gòu)象轉(zhuǎn)變，會導致產(chǎn)率降低[26?27]，因此選擇1.4 mg/mL氫氧化鈉濃度作為堿濃度的中間值進行響應面法考察優(yōu)化。

圖4 氫氧化鈉濃度對藏紅花酸產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of sodium hydroxide concentration on the yield of crocetin

2.3.2 反應時間的影響 由圖5可知，在15~60 min時產(chǎn)率隨反應時間增加，60 min時反式藏紅花酸的產(chǎn)率達到最大值79.14%，隨后在60~120 min，隨著反應時間的增加產(chǎn)率反而有小幅度降低。這個現(xiàn)象與前面2.2結(jié)果類似，長時間的水解會引起藏紅花酸的氧化降解，從而導致產(chǎn)率降低[25]。因此選擇60 min作為時間參數(shù)的中間值進行響應面法考察優(yōu)化。

圖5 反應時間對藏紅花酸產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of crocetin

2.3.3 反應溫度的影響 由圖6可知，50~80 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度升高反式藏紅花酸產(chǎn)率逐漸升高到80.24%，90℃時，產(chǎn)率出現(xiàn)了明顯的下降。高溫雖然可以加快藏紅花素的水解速度，但反式藏紅花酸中存在大量共軛雙鍵，高溫下容易受熱降解，產(chǎn)率降低[25,27?28]。因此選擇70 ℃作為溫度參數(shù)的中間值進修響應面法考察優(yōu)化。

圖6 反應溫度對藏紅花酸產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of temperature on the yield of crocetin

2.4 響應面試驗結(jié)果

2.4.1 建立回歸模型及方差分析 根據(jù)單因素結(jié)果，選擇反應時間（A）、反應溫度（B）和氫氧化鈉濃度（C）這三個參數(shù)的中間值及上下限見表1，采用Box-Behnken試驗設計進行響應面試驗（表2），回歸方程擬合結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計和結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表3 回歸方程顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression equation

使用軟件JMP14對實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，結(jié)果見表3。

反應時間、反應溫度、氫氧化鈉濃度與反式藏紅花酸產(chǎn)率（Y）的二次多元回歸方程為：

方差分析顯示模型顯著（P<0.05），失擬項不顯著（P>0.05），因此模型能夠預測水解工藝。由表3可知，反應時間、反應溫度、氫氧化鈉濃度一次項及其交互項對反式藏紅花酸的產(chǎn)率均有顯著的影響；由F值可得出對產(chǎn)率的影響順序為反應溫度>氫氧化鈉濃度>反應時間。

2.4.2 響應面交互作用分析及最優(yōu)條件的驗證 反應溫度、反應時間、氫氧化鈉濃度對于產(chǎn)率的交互作用響應面圖見圖7。

圖7 各因素交互作用對藏紅花酸產(chǎn)率的影響Fig.7 Response surface plots for the effects of various variables on yield of crocetin

各因素的交互作用在圖中表現(xiàn)為，交互作用越大，曲面的陡峭程度和等高線的密度越高并且更加橢圓[29]。從圖7可以看出，反應時間和反應溫度的交互作用對于反式藏紅花酸的產(chǎn)率影響最為顯著（P<0.01），曲面陡峭并且等高線很密集呈扁平的橢圓形；其次是反應時間和氫氧化鈉濃度的交互作用對于產(chǎn)率的影響極顯著（P<0.01），曲面陡峭且等高線密集呈橢圓形狀；反應溫度和氫氧化鈉濃度的交互作用對于反式藏紅花酸的產(chǎn)率影響顯著（P<0.05），曲面坡度變化相比前兩種交互作用較為平緩，等高線稀密集呈橢圓形狀。

利用JMP （v14.0）軟件對響應面試驗結(jié)果進行分析，理論計算得到最大產(chǎn)率為81.32%，此時反應時間為55.68 min，反應溫度為77.99 ℃，氫氧化鈉濃度為1.69 mg/mL。為方便實驗操作，選擇最佳反應時間為60.0 min，反應溫度為80.0 ℃，氫氧化鈉濃度為1.70 mg/mL。使用上述最優(yōu)條件進行三次平行實驗，得到反式藏紅花酸的實際平均產(chǎn)率為80.09%±0.09%，與預測值80.18%無顯著性差異（P>0.05），參數(shù)優(yōu)化后粗品中反式藏紅花酸純度為86%。

2.5 反式藏紅花酸的純化及結(jié)構(gòu)鑒定

通過重結(jié)晶的方法精制純化得到反式藏紅花酸晶體（圖8），經(jīng)HPLC采用歸一化法驗證純度為99.3%。精制純化后的反式藏紅花酸的1H NMR和13C NMR鑒定光譜數(shù)據(jù)如圖9、表4所示，與文獻報道基本一致[30]。

圖8 純化后的反式藏紅花酸晶體Fig.8 Crystals of trans-crocetin after purification

表4 制備的反式藏紅花酸的核磁共振氫譜（600 MHz,）、碳譜 (151Hz)數(shù)據(jù)（DMSO-d6）Table 4 1H and 13C-NMR (600 and 151 MHz) data of purified trans-crocetin（DMSO-d6）

圖9 制備的反式藏紅花酸的氫譜、碳譜譜圖（DMSO-d6）Fig.9 1H and 13C-NMR (600 and 151 MHz) spectrogram of purified trans-crocetin（DMSO-d6）

3 結(jié)論

由于藏紅花酸含有多個共軛雙鍵，所以水解工藝中的反應溫度、反應時間和氫氧化鈉濃度對反式藏紅花酸產(chǎn)率的影響最為顯著。本研究先采用響應面法及星點設計對藏紅花素堿水解制備反式藏紅花酸的工藝進行了優(yōu)化分析，并從二元回歸模型方差分析對影響反式藏紅花酸產(chǎn)率的因素之間的相互作用進行了探討。結(jié)果得出最佳工藝參數(shù)為：反應時間為 60.0 min，溫度為 80.0 ℃，氫氧化鈉濃度為1.70 mg/mL，此條件下反式藏紅花酸的產(chǎn)率為80.09%±0.09%。利用pH=7~8時反式藏紅花酸比順式藏紅花酸溶解度低的特點，經(jīng)過重結(jié)晶工藝得到了純度99.3%的反式藏紅花酸，為反式藏紅花酸的進一步開發(fā)利用奠定了工作基礎。