段安樂，趙劍芳，郭艷，周歡，王云霞，李汭璇，段磊

1.甘肅省第三人民醫(yī)院消化科，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅蘭州 730000

胃癌大多起源于胃黏膜細(xì)胞，是第四大最常見的癌癥[1]。 約70%～85%的胃癌患者在確診后5年內(nèi)死亡，與多數(shù)癌癥類似，胃癌的高病死率主要是由于確診時間過晚和治療方法有限所致[2]。盡管近幾十年來，包括免疫療法，放射療法和手術(shù)切除在內(nèi)的多模式治療策略已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，然而胃癌依然是難以解決的公共衛(wèi)生問題[3]。自 “精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)” 概念提出以來，分子病理學(xué)檢測方法和靶向療法的改進(jìn)顯著提高了胃癌患者的生存率[4]。 然而由于胃癌分子機(jī)制目前尚不明確， 使得胃癌分子病理學(xué)和靶向治療面臨諸多困難。 因此，探究更有效的關(guān)鍵分子對于胃癌的治療至關(guān)重要。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶形成體1(NADPH Oxidase Organizer 1, NOXO1) 是NADPH 氧化酶家族的成員之一，該家族是體內(nèi)氧化還原信號的關(guān)鍵酶[5]。NADPH 氧化酶催化生成的活性氧可促進(jìn)腫瘤的生成，而腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。NADPH 氧化酶家族成員在肺癌、肝癌、黑色素瘤、前列腺癌和食管癌等腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[7]。關(guān)于NOXO1 在胃癌中的作用尚未報道。 因此該研究是應(yīng)用生物信息學(xué)分析，從而探究了NOXO1 在胃癌中的關(guān)鍵作用。 該研究填補(bǔ)了NOXO1 在胃癌中研究的空白，為胃癌分子病理學(xué)和靶向治療的研究提供指導(dǎo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究用于分析NOXO1 的數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)，從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得胃癌患者的年齡、性別、種族、分析、腫瘤純度、基因測序數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后資料。 探究NOXO1 在胃癌中作用的分析均基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中所有的胃癌患者數(shù)據(jù)。 探究NOXO1 在正常人體中表達(dá)情況的數(shù)據(jù)來源于人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。

1.2 方法

應(yīng)用GEPIA2 和TIMER 在線工具基于胃癌基因測序數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后資料探究了NOXO1 在胃癌中的表達(dá)情況和預(yù)后價值。 為了確定NOXO1 是否為胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，在該研究中我們對胃癌常見的臨床特征(年齡、性別、種族、分期和腫瘤純度)進(jìn)行了單因素Cox 回歸和多因素Cox 回歸。應(yīng)用人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜繪制了NOXO1 在人體各個器官中的表達(dá)圖譜，主要分析了mRNA 和蛋白水平的表達(dá)情況。為了確定NOXO1 與胃癌治療靶點(diǎn)的相關(guān)性，該研究不僅探究了NOXO1 與VEGFA 在胃癌中的相關(guān)性，而且探究了其在所有腫瘤中是否存在相關(guān)性。 在TIMER 數(shù)據(jù)庫對NOXO1 與免疫細(xì)胞的相關(guān)性進(jìn)行了探究。 為了更深入探究NOXO1 與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，該研究探究了其與免疫細(xì)胞亞型的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用Limma 分析用于分析NOXO1 在胃癌與正常組織的表達(dá)差異； 應(yīng)用Kaplan-Meier 生存分析探究NOXO1 在胃癌中的預(yù)后價值；單因素Cox 回歸和多因素Cox 回歸探究包括NOXO1 在內(nèi)的多種因素對于胃癌預(yù)后的影響。 所有相關(guān)性分析方法采用Pearson 相關(guān)性分析，基于R 語言實(shí)現(xiàn)(版本：4.1.0)實(shí)現(xiàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOXO1 的表達(dá)驗(yàn)證

在TIMER 中，NOXO1 與在各種癌腫中的表達(dá)結(jié)果顯示(見圖1A)，相比于癌旁組織，NOXO1 在BLCA,BRCA，COAD，ESCA，HNSC，KIHC，KIRC，LUAD，LUSC和STAD 等諸多癌癥中表達(dá)增高。 在GEPIA2 中，NOXO1 在COAD，PAAD 和STAD 中表達(dá)增高， 而其在GBM 和TGCT 中的表達(dá)降低(見圖1B)。 兩分析平臺結(jié)果均顯示NOXO1 在胃癌中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 NOXO1 在各種癌癥中的差異表達(dá)

2.2 NOXO1 與胃癌和其他腫瘤預(yù)后的相關(guān)性

NOXO1 在不同數(shù)據(jù)庫中與胃癌預(yù)后的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NOXO1 的高表達(dá)均與胃癌患者預(yù)后較好呈正相關(guān)(見圖2 A, B)。 NOXO1 與所有腫瘤患者預(yù)后的熱圖顯示(見圖2C)，NOXO1 與ACC，CHOL，HNSC 和STAD 等患者的預(yù)后密切相關(guān)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 NOXO1 與在不同數(shù)據(jù)庫與胃癌和其他腫瘤預(yù)后的關(guān)系

2.3 NOXO1 與臨床特征單多變量Cox 回歸分析的結(jié)果

單變量Cox 回歸分析結(jié)果顯示，年齡(HR=1.020,P=0.009)，3 期(HR=2.526, P=0.003)，4 期(HR=4.088,P＜0.001)和NOXO1(HR=0.834, P=0.001)與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 多變量Cox 回歸分析的結(jié)果也表明，年齡(HR=1.032, P=0.001)，3 期(HR=2.753, P=0.005)，4 期(HR=3.921, P=0.007)和NOXO1(HR=0.801, P=0.001)與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表1、表2。

表1 單因素Cox 回歸分析結(jié)果

表2 多因素Cox 回歸分析結(jié)果

2.4 NOXO1 在人體正常器官中的表達(dá)情況

NOXO1 在人體組織中表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果顯示(見圖3)， 在人體正常組織中mRNA 層面的表達(dá)結(jié)果顯示，NOXO1 在腦、消化道、男性生殖系統(tǒng)和骨髓淋巴系統(tǒng)等多種器官中表達(dá)較高，人體正常組織中蛋白層面的表達(dá)結(jié)果表明，NOXO1 在消化道和男性生殖系統(tǒng)表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 NOXO1 在人體組織中的表達(dá)驗(yàn)證

2.5 NOXO1 與VEGFA 的關(guān)系

NOXO1 與VEGFA 的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在所有腫瘤中NOXO1 與VEGFA 沒有明確的相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4A。 而在胃癌組織當(dāng)中，NOXO1 與VEGFA 呈正相關(guān) (r=0.13, P=0.01)，見圖4B。 NOXO1 在胃癌和其他腫瘤中相關(guān)性分布情況見圖4C。

圖4 NOXO1 與VEGFA 的相關(guān)性

2.6 NOXO1 與免疫的相關(guān)性

NOXO1 在胃癌中與腫瘤純度及免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，其與B 細(xì)胞(P=0.009)，巨噬細(xì)胞(P=0.001)關(guān)系密切，其中與巨噬細(xì)胞最為相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。 同NOXO1 與巨噬細(xì)胞亞型的相關(guān)性的結(jié)果表明，NOXO1 的表達(dá)與巨噬細(xì)胞亞型在多數(shù)腫瘤中存在相關(guān)性，其中在胃癌中，NOXO1 的表達(dá)與M0 巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，而與M2 巨噬細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

圖5 NOXO1 與腫瘤純度及免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

圖6 NOXO1 與巨噬細(xì)胞亞型的相關(guān)性及在各大腫瘤中其與VEGFA 的相關(guān)性

3 討論

在正常組織中，NOXO1 可通過促進(jìn)NOX1 和NOX3 催化氧化還原反應(yīng)[8]。 NOXO1 可通過促進(jìn)NOX1的活性和活性氧的生成，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[9]。除此之外，NOXO1 可通過促進(jìn)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞的增殖和抑制凋亡促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖和侵襲[10]。 有學(xué)者通過動物實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB 在TNF-α 可直接調(diào)控NOXO1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[11]。 NOXO1 也與食管癌的耐藥相關(guān)[12]。 NOXO1 在多種腫瘤的分子機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，而關(guān)于NOXO1 在胃癌中的具體功能目前尚不清楚。

在該研究中， 我們發(fā)現(xiàn)NOXO1 在胃癌中高表達(dá)，且為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素，其高表達(dá)提示患者預(yù)后較好。 NOXO1 在結(jié)腸癌中高表達(dá)[10]，而在胃癌中的表達(dá)情況尚不清楚。 NOXO1 與預(yù)后的關(guān)系是否受表觀遺傳學(xué)的影響，以至NOXO1 的高表達(dá)與患者預(yù)后較好呈正相關(guān)，該研究不能提供可靠的證據(jù)。 該研究未涉及蛋白層面的驗(yàn)證，關(guān)于具體調(diào)控機(jī)制，仍需進(jìn)一步生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

VEGFA 的主要功能是促血管擴(kuò)張和通透性，是多種腫瘤的治療靶點(diǎn)[13]針對VEGFA 的靶向藥物主要有貝伐珠單抗。 VEGFA 主要與胃癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成相關(guān)， 在實(shí)驗(yàn)動物動物體內(nèi)抑制VEGFA 可以明顯抑制腫瘤移植物的生長[14]。 在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)NOXO1 與VEGFA 的表達(dá)呈正相關(guān)，其可能與VEGFA 共同作用而在胃癌中發(fā)揮作用。 因此對于NOXO1 和VEGFA 具體關(guān)系的探究將會為VEGFA 靶向治療提供指導(dǎo)。

腫瘤微環(huán)境因其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用而備受關(guān)注。 該研究中， 我們通過分析NOXO1 與免疫細(xì)胞的關(guān)系， 發(fā)現(xiàn)NOXO1 與B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞關(guān)系密切。 NOXO1 與巨噬細(xì)胞亞型相關(guān)性分析結(jié)果表明，NOXO1 的表達(dá)與M0 巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)， 而與M2 巨噬細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)。相關(guān)學(xué)者通過免疫組織化和生存分析表明，胃癌中主要浸潤的B 細(xì)胞是記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞，而且CD20+B 細(xì)胞與胃癌的生存密切相關(guān)[15]。 M2巨噬細(xì)胞的高浸潤在胃癌中被認(rèn)為是免疫抑制的特征，可能導(dǎo)致不良的預(yù)后[16]，趨化因子受體CXCR3 可通過降低M2 巨噬細(xì)胞的浸潤而與患者預(yù)后較好相關(guān)[17]。 Wang 等的一項(xiàng)meta 分析表明，M1 巨噬細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞的高浸潤提示患者預(yù)后較差， 而M2 巨噬細(xì)胞的浸潤提示胃癌患者預(yù)后較好[18]。 基于以上研究， 我們大膽推測，NOXO1 雖然在胃癌中高表達(dá)，但是與預(yù)后較好呈正相關(guān)的原因可能與其對M0 巨噬細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)有關(guān)，至于是直接調(diào)控還是間接調(diào)控，仍需我們進(jìn)一步證明。 然而目前關(guān)于M0 巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞在胃癌中的具體作用目前尚不清楚，對于這方面的進(jìn)一步研究可深入的了解NOXO1 的免疫調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，在該研究中，基于基因測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)NOXO1 可作為胃癌新的治療靶點(diǎn)。 并發(fā)現(xiàn)NOXO1與胃癌治療靶點(diǎn)VEGFA 呈正相關(guān)。 有趣的是，該研究發(fā)現(xiàn)NOXO1 可調(diào)節(jié)B 細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞的浸潤，這可能影響胃癌患者惡的預(yù)后。這項(xiàng)研究不僅填補(bǔ)了胃癌分子機(jī)制研究的空白，而且為胃癌靶向治療的探究提供新的思路。