袁 芳，王 靖，蘭小中

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院西藏特色農(nóng)牧資源協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏 林芝 860000)

藏藥“五根”之一的喜馬拉雅紫茉莉(Mirabilishimalaica(Edgew.) Heimerl)是西藏Ⅰ級(jí)瀕危藏藥材之一，藏文音譯“巴朱”[1]?！吨袊参镏尽穼⑵錃w入紫茉莉科(Nyctaginaceae)山紫茉莉?qū)?Oxybaphus)，新擬名為山紫茉莉(O.himalaicusEdgew.)和變種中華山紫茉莉(O.himalaicusEdgew. var.chinensis)，主產(chǎn)于西藏東部及喜馬拉雅山區(qū)[2]。以根入藥，具有溫腎益腎、滋補(bǔ)生肌、利尿排石等功效，可消炎、止痛，是二十五味兒茶丸、紅花如意丸、十四味羚牛角丸和熱巴羅布膏等30余種藏藥成方制劑的主要原料之一[3-4]。從該種植物中分離得到的黃酮類化合物、生物堿類化合物、三萜類化合物以及多糖類化合物，具有抗病毒、抗癌、降血糖等活性[5-8]。

喜馬拉雅紫茉莉人工馴化與栽培處于初始階段，種植規(guī)模不大，規(guī)范化種植技術(shù)尚不完善，采挖野生藥材的現(xiàn)象仍然存在[9]。隨著藏藥工業(yè)化生產(chǎn)速度加快、市場開拓力度加強(qiáng)，對(duì)喜馬拉雅紫茉莉藥理作用及其藥用范圍的不斷深化拓展，對(duì)其原料藥的需求量越來越大。目前，喜馬拉雅紫茉莉野生資源已經(jīng)處于匱乏狀態(tài)。開展藏藥材野生馴化及人工種植是保護(hù)藏藥材野生資源并解決市場資源緊缺問題的有效途徑。

喜馬拉雅紫茉莉以種子繁殖為主[10-11]，研究其種子萌發(fā)特性，最大程度地提高種子的發(fā)芽率對(duì)實(shí)現(xiàn)其人工規(guī)模化種植至關(guān)重要，但是目前有關(guān)此方面的研究鮮有報(bào)道。蘭小中等[10]研究表明，喜馬拉雅紫茉莉的種子采收后在室溫下貯藏1～4年皆可萌發(fā)，但隨著貯藏年限的延長，種子會(huì)出現(xiàn)褪變現(xiàn)象，黑暗有利于種子萌發(fā)。盧驍?shù)萚11]研究表明，喜馬拉雅紫茉莉的成熟種子有分泌粘液的特性，有粘液種子的發(fā)芽率比去掉粘液種子的發(fā)芽率高8.3%左右。雖然國內(nèi)學(xué)者開展了一些喜馬拉雅紫茉莉種子質(zhì)量及萌發(fā)特性的研究，但仍不足以闡明喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)特性。

因此，本研究以喜馬拉雅紫茉莉的種子為試驗(yàn)材料，探討不同消毒方法、浸種時(shí)間以及植物生長調(diào)節(jié)劑處理對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在為這一珍貴藥用植物資源的保護(hù)和栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

喜馬拉雅紫茉莉種子于2019年9月采自西藏林芝市西藏農(nóng)牧學(xué)院藏藥材種質(zhì)資源圃。種子自然干燥后在通風(fēng)、干燥、避光的室內(nèi)存儲(chǔ)。于2020年5月開展實(shí)驗(yàn)。種子千粒重為14.457 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子消毒與浸種時(shí)間處理

將種子用流水沖洗5 min后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，分別進(jìn)行如下處理： 1) 只用無菌水沖洗種子5次后接種到無菌萌發(fā)紙上，將該處理作為對(duì)照。 2) 用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，然后用0.1% HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗3次。 3) 用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，然后用3% H2O2消毒3 min，無菌水沖洗3次。種子經(jīng)各種方法消毒后，分別用無菌水經(jīng)不同時(shí)間的浸種，然后接種于無菌萌發(fā)紙上。浸種時(shí)間設(shè)置為不浸種、浸種12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h共7個(gè)處理。以上消毒和浸種時(shí)間各處理均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2植物生長調(diào)節(jié)劑處理

根據(jù)1.2.1的試驗(yàn)結(jié)果，種子用最適消毒方法消毒后用無菌水浸泡適當(dāng)時(shí)間，然后濾去多余的水分，用不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑浸種5 min。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和赤霉素(GA3)6種植物生長調(diào)節(jié)劑，濃度分別設(shè)置為6-BA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，NAA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，IAA(2、 4、6、8、10 mg·L-1)，IBA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，2,4-D(2、4、6、8、10 mg·L-1)，GA3(20、50、100、150、200、250、300、400 mg·L-1)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)皿。

上述試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿紙床發(fā)芽法，將兩層PhytoTC種子萌發(fā)紙鋪在培養(yǎng)皿中高溫高壓滅菌后烘干備用。所用試劑均用無菌水配制，植物生長調(diào)節(jié)劑母液抽濾滅菌。將培養(yǎng)皿內(nèi)的萌發(fā)紙用4 mL無菌水(消毒與浸種時(shí)間處理)或植物生長調(diào)節(jié)劑溶液(植物生長調(diào)節(jié)劑處理)浸濕，種子均勻接種在萌發(fā)紙上，并用Parafilm封口膜進(jìn)行封口。在培養(yǎng)箱中于20 ℃、全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。每14 d向各處理培養(yǎng)皿中加入4 mL無菌水。

1.2.3測定指標(biāo)與計(jì)算公式

從處理當(dāng)天開始，每24 h記錄各培養(yǎng)皿中萌發(fā)的種子數(shù)，胚根露出種孔3 mm視為種子萌發(fā)。連續(xù)7 d對(duì)照組和試驗(yàn)組的種子萌發(fā)數(shù)不變時(shí)視為種子萌發(fā)進(jìn)程結(jié)束，并測定幼苗的根長、莖長、鮮重和干重。

發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間，即萌發(fā)時(shí)滯，指從萌發(fā)試驗(yàn)開始到第1粒種子開始萌發(fā)所持續(xù)的天數(shù)；發(fā)芽持續(xù)時(shí)間，即種子開始萌發(fā)到最后1粒種子萌發(fā)的總天數(shù)；

帶菌率(%)=(污染種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽初期(前4 d)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，

式中：Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=S×GI，

式中：S為幼苗平均鮮質(zhì)量，GI為發(fā)芽指數(shù)[12-13]。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行整理和作圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法與浸種時(shí)間處理對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表1可知，所試的21種處理下，只有10種處理的種子有少數(shù)萌發(fā)。從污染情況來看，75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min的消毒效果最好，75%乙醇1 min+3% H2O23 min次之，只用無菌水沖洗5次的種子污染較嚴(yán)重，但帶菌率均低于27%；另外，各消毒方法處理下的種子隨著浸種時(shí)間的延長帶菌率呈升高趨勢。從種子的萌發(fā)情況來看，只用無菌水沖洗5次的種子總體發(fā)芽情況較好，75%乙醇1 min+3% H2O23 min次之，75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min處理下的種子發(fā)芽率最低，并且各消毒處理下的種子隨著浸種時(shí)間的延長，發(fā)芽率顯著下降。將種子用無菌水沖洗5次后，不經(jīng)過浸泡直接接種到無菌萌發(fā)紙上進(jìn)行培養(yǎng)，雖然種子帶菌率為3.74%，但是種子的發(fā)芽率最高，為30.64%。

表1 不同消毒方法與浸種時(shí)間處理對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different disinfection treatments and seed-soaking time on seed germination of M. himalaica

2.2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

2.2.1不同濃度IBA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表2可知，IBA 2～10 mg·L-1時(shí)對(duì)種子萌發(fā)有一定的抑制作用。與對(duì)照相比較，種子發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間和發(fā)芽持續(xù)時(shí)間呈延長趨勢，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，活力指數(shù)則高于對(duì)照。綜上可知，IBA不利于種子萌發(fā)，但是可以促進(jìn)幼苗生長增加鮮重。

表2 不同濃度IBA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different concentrations of IBA on seed germination of M. himalaica

2.2.2不同濃度6-BA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表3可知，6-BA 2～10 mg·L-1時(shí)均可適當(dāng)縮短發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間；在發(fā)芽持續(xù)時(shí)間方面，2 mg·L-1處理與對(duì)照無顯著差異，4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1處理比對(duì)照延長。2～10 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于對(duì)照；其中10 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，比對(duì)照分別提高33.03%、31.36%、10.24和1.21。綜上可知，在試驗(yàn)設(shè)定的不同濃度6-BA處理中，濃度為10 mg·L-1浸種效果最好。

表3 不同濃度6-BA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA on seed germination of M. himalaica

2.2.3不同濃度2,4-D對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表4可知，2,4-D 2～10 mg·L-1時(shí)對(duì)種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的抑制作用。發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間比對(duì)照顯著延長；發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)也顯著低于對(duì)照；從活力指數(shù)顯示，2,4-D 2～4 mg·L-1可以促進(jìn)幼苗生長，6～10 mg·L-1則顯著抑制幼苗生長。

表4 不同濃度2,4-D對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of different concentrations of 2,4-D on seed germination of M. himalaica

2.2.4不同濃度IAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表5可知，IAA 2、6、8、10 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)低于對(duì)照，4 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，比對(duì)照分別提高2.29%、2.98和0.86，發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間比對(duì)照提前1.33 d，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間則比對(duì)照延長4.67 d。綜上可知，IAA 4 mg·L-1對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長有一定的促進(jìn)作用。

表5 不同濃度IAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of different concentrations of IAA on seed germination of M. himalaica

2.2.5不同濃度NAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表6可知，NAA不同濃度處理對(duì)種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的抑制作用，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對(duì)照；當(dāng)NAA濃度大于4 mg·L-1時(shí)，不利于幼苗的生長。

表6 不同濃度NAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of different concentrations of NAA on seed germination of M. himalaica

2.2.6不同濃度GA3對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表7可知，不同濃度的GA3處理對(duì)種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的促進(jìn)作用，并且對(duì)延遲發(fā)芽持續(xù)時(shí)間也有一定的作用。在各處理下，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均明顯高于對(duì)照；其中，在300 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)最高，比對(duì)照分別提高22.49%、22.49%和1.16，發(fā)芽指數(shù)也比對(duì)照提高8.22。綜上可知，在試驗(yàn)設(shè)定的不同濃度GA3處理中，濃度為300 mg·L-1浸種效果最好。

表7 不同濃度GA3對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 7 Effects of different concentrations of GA3 on seed germination of M. himalaica

2.2.76-BA、IAA和GA3最優(yōu)處理的比較分析

對(duì)2.2.1～2.2.6所試的不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理進(jìn)行綜合比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBA、2,4-D和NAA在濃度為2～10 mg·L-1時(shí)，對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照。IAA對(duì)種子萌發(fā)也有一定的抑制作用，但在濃度為4 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)則高于對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)定的6-BA和GA3各濃度處理均可促進(jìn)喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)。

對(duì)6-BA、IAA和GA3的最優(yōu)濃度處理進(jìn)行比較分析。由圖1可知，用6-BA 10 mg·L-1和GA3300 mg·L-1處理的種子各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均顯著高于對(duì)照；IAA 4 mg·L-1處理的種子除了發(fā)芽勢低于對(duì)照外，其余指標(biāo)均高于對(duì)照，但差異不明顯；3種最優(yōu)濃度處理中，6-BA 10 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，分別為63.67%、62.00%、16.47和1.43，與對(duì)照相比較，發(fā)芽率提高了1.01倍，發(fā)芽勢提高了0.96倍，發(fā)芽指數(shù)提高了1.65倍，活力指數(shù)提高了5.50倍。

圖1 6-BA、IAA和GA3處理對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of the treatments with 6-BA, IAA and GA3 on seed germination of M. himalaica

綜上可知，6-BA 10 mg·L-1對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最顯著。

2.3 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長的影響

由表8可知，不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子幼苗的生長影響不同。IBA 2～10 mg·L-1處理，隨著濃度的增大，幼苗的根長、莖長、鮮重和干重呈先升高后降低的趨勢，但是鮮重增長較明顯；在IBA 4 mg·L-1時(shí)，根長、莖長、鮮重和干重均高于對(duì)照，其中莖長和鮮重達(dá)到所有處理的最大值，分別為71.52 mm和137.10 mg。在6-BA 2～10 mg·L-1處理中，隨著濃度的增大，根長、莖長和鮮重呈升高的趨勢；6-BA 2 mg·L-1對(duì)根伸長生長有明顯的促進(jìn)作用，根長達(dá)93.50 mm；6-BA 8～10 mg·L-1處理有利于幼苗干物質(zhì)的積累。2,4-D 2～10 mg·L-1對(duì)根長、莖長、鮮重和干重有一定的抑制作用。IAA 2～10 mg·L-1處理的種子與對(duì)照相比較，其幼苗的根長、莖長和鮮重都有不同程度的升高，其中在IAA 8 mg·L-1時(shí)根長達(dá)到所有處理的最大值，為111.69 mg；干重僅在IAA 2 mg·L-1處理時(shí)高于對(duì)照，其余處理均低于對(duì)照。NAA 2～10 mg·L-1處理下幼苗根長均低于對(duì)照；莖長和鮮重隨著NAA濃度增大呈先升高后降低的趨勢；對(duì)幼苗干物質(zhì)的積累總體上表現(xiàn)為抑制作用。在GA320～400 mg·L-1處理下，幼苗的莖長、鮮重和干重均高于對(duì)照，其中GA3250～400 mg·L-1處理下，干重達(dá)到所有處理的最大值，平均干重大于8.00 mg；GA3濃度大于300 mg·L-1時(shí)會(huì)抑制根的伸長生長。

表8 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長的影響Table 8 Effects of different concentrations of plant growth regulators on seedling growth of M. himalaica

3 結(jié)論與討論

種子活力的保持和成功萌發(fā)成苗決定著植物種群的繁衍和生存，也決定植物進(jìn)入自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的時(shí)間[14]。因此，種子萌發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義。影響種子萌發(fā)的因素有很多，包括外部生態(tài)因素和內(nèi)部生理因素，對(duì)不同植物來說，影響種子萌發(fā)的主要因子也有差異[14-15]。

種子帶菌會(huì)引起種苗病害。本試驗(yàn)中所試的2種消毒方法(75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min和75%乙醇1 min+3% H2O23 min)均能達(dá)到較好的消毒效果，但是發(fā)芽率顯著低于對(duì)照。其原因可能是，HgCl2易在種子上殘留，不易分解，從而對(duì)種子產(chǎn)生持續(xù)的毒害，降低種子發(fā)芽率；H2O2有一定的腐蝕性，消毒時(shí)間較長則可能破壞了種子結(jié)構(gòu)。只用無菌水沖洗5次后直接接種的種子，雖然帶菌率為3.74%，但是種子發(fā)芽率顯著高于消毒處理。另外在浸種時(shí)間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，種子污染情況愈發(fā)嚴(yán)重，并且嚴(yán)重影響到種子發(fā)芽和幼苗生長。喜馬拉雅紫茉莉種子在遇水后很快在種子表面出現(xiàn)白色的黏液。種子黏液是在種皮外層細(xì)胞的高爾基體內(nèi)產(chǎn)生并分泌到胞腔內(nèi)或細(xì)胞壁層的吸濕膨脹的果膠類多糖物質(zhì)[10-11]。種子黏液不利于消毒劑充分接觸被消毒材料，并且給一些微生物提供了“藏身之所”。

外源激素法是揭示種子休眠和萌發(fā)的激素調(diào)控機(jī)理的重要研究方法，已被廣泛應(yīng)用于種子萌發(fā)特性研究，使用植物生長調(diào)節(jié)劑浸種可以打破種子休眠，破壞妨礙種子萌發(fā)的活性物質(zhì)，從而促進(jìn)種子胚的發(fā)育和種子發(fā)芽[14]。本試驗(yàn)中，IBA、2,4-D、NAA和IAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)主要表現(xiàn)為抑制作用，一定濃度的6-BA和GA3可以促進(jìn)種子萌發(fā)。6-BA具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、種子發(fā)芽、誘導(dǎo)休眠芽生長，以及抑制或促進(jìn)莖、葉和根的生長等生理作用[16]。GA3具有促進(jìn)細(xì)胞伸長，解除種子、塊莖的休眠并促進(jìn)萌發(fā)等生理作用[17]。本試驗(yàn)中，6-BA 10 mg·L-1對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最顯著，其次是GA3300 mg·L-1。

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)幼苗生長也有巨大的影響[16,18]。在本試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，6-BA、GA3、IBA和IAA對(duì)喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長有明顯的促進(jìn)作用，NAA和2,4-D不利于幼苗干物質(zhì)的累積。