葉文芳，陳嘉聰，王曉琴，張豐蕓，黃秀麗，朱文娟，趙智鋒

（惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 516000）

近年，由椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans，簡(jiǎn)稱椰酵假單胞菌）引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，椰酵假單胞菌在適宜的條件下會(huì)產(chǎn)生米酵菌酸（bongkrekic acid）和毒黃素（toxoflavin）[1-3]。其中，米酵菌酸毒性強(qiáng)于毒黃素，是主要致死因子。毒黃素毒性雖弱于米酵菌酸，但毒黃素會(huì)造成組織與細(xì)胞損傷，同時(shí)毒黃素還具有致突變作用和潛在的致癌性[4-6]。

一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）是利用易得、廉價(jià)、有效的化學(xué)物為代表性成分，借助待測(cè)物中有效成分的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，以一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子，并通過其計(jì)算含量，使其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值符合定量方法學(xué)的要求，實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)測(cè)定[7]。本研究選取米酵菌酸為內(nèi)參物，考察米酵菌酸與毒黃素之間的相對(duì)校正因子，探討QAMS用于毒黃素含量測(cè)定的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，配DAD 檢測(cè)器（日本島津公司）；Agilent 1200 高效液相色譜儀，配DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀（廈門睿科）。

1.2 材料

米酵菌酸（純度≥95 %，上海安譜）；毒黃素（純度≥98 %，上海甄準(zhǔn)）；增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（QuEChERS dSPE EMR-Lipid，廣州安捷倫）；除脂萃取鹽包（Polish Tube-NaCl/MgSO4，廣州安捷倫科）；固相萃取凈化管（dSPE Cleaneup Tubes，成分配比：MgSO4300 mg，PSA 100 mg，C18100 mg，容量15 ml，上海安譜）；Cleanert?MAS-Q系列酸性物質(zhì)凈化固相萃取柱（成分配比：PSA 400 mg，C18400 mg，MgSO41.2 g，容量15 ml，天津博納艾杰爾）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；分析樣品濕米粉、銀耳、黑木耳、玉米面均為本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢的樣品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和水（B），水用甲酸調(diào)pH 3.0；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl，梯度洗脫程序見表1。

表1 毒黃素和米酵菌酸的測(cè)定梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液配制

準(zhǔn)確稱取米酵菌酸對(duì)照品10 mg，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加甲醇定容；準(zhǔn)確稱取毒黃素對(duì)照品10 mg，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加甲醇定容。準(zhǔn)確吸取上述溶液各25 ml，置于同一50 ml量瓶中，配制成50 μg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成毒黃素、米酵菌酸濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 μg/ml的系列混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品前處理

取粉碎混勻的試樣約2 g，精密稱定，于50 ml塑料離心管中，加入甲醇-水（8:2，v/v）10 ml，渦旋2 min，超聲10 min，5000 r/min離心5 min，吸取上清至預(yù)裝dSPE EMR-Lipid吸附劑的離心管中，渦旋2 min，5000 r/min離心5 min，然后取上清于氮吹管中；重復(fù)上述提取、凈化步驟，合并上清后于40 ℃水浴中氮吹至低于1 ml，用甲醇定容至1 ml，0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取方法及色譜條件的優(yōu)化

以濕米粉為基質(zhì)，考察不同提取溶劑（甲醇、乙腈、80 %甲醇、80 %乙腈），提取次數(shù)，流動(dòng)相pH值（pH 2.5，pH 3.0，pH 3.5）及其酸度調(diào)節(jié)劑（甲酸、乙酸、磷酸），以及檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)毒黃素及米酵菌回收率的影響。結(jié)果表明，以80 %甲醇為提取溶劑，提取2次，以甲酸作為流動(dòng)相B的酸度調(diào)節(jié)劑，流動(dòng)相B pH 3.0及檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm時(shí)，毒黃素和米酵菌酸的回收率均最優(yōu)。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系、方法檢出限及定量限 分別精密吸取2.2項(xiàng)下系列濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，米酵菌酸和毒黃素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，米酵菌酸和毒黃素在0.5～25 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.99999和0.99991。線性關(guān)系、方法檢出限及定量限見表2。

表2 米酵菌酸和毒黃素的線性關(guān)系、方法檢出限及定量限

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濕米粉樣品，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，6，12，18，24，30，36 h進(jìn)樣10 μl，測(cè)定，測(cè)得18 h內(nèi)毒黃素峰面積RSD為4.79 %，而后峰面積明顯衰減，24，30，36 h的RSD分別為6.13 %，7.46 %，8.95 %，RSD均大于5 %；36 h內(nèi)米酵菌酸峰面積RSD為0.83 %，穩(wěn)定性較好。

3.2.3 方法回收率與精密度 選取銀耳、黑木耳、玉米面及濕米粉4種不同基質(zhì)，進(jìn)行3水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn), 每種基質(zhì)的每個(gè)水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果見表3。在2，8，16 μg/ml 3個(gè)加標(biāo)水平下，毒黃素的平均回收率為88.94 %，RSD為1.50 %；米酵菌酸的平均回收率為90.43 %，RSD為1.43 %。結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表3 毒黃素和米酵菌酸的回收率結(jié)果（n=6）

4 相對(duì)校正因子的建立及其適用性評(píng)價(jià)

4.1 相對(duì)校正因子（f）的建立

精密吸取2.2.4項(xiàng)下混合對(duì)照品工作溶液，分別取1，2，5，10，15，20 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以米酵菌酸為內(nèi)參物，按下式計(jì)算QAMSf值，結(jié)果見表4。

表4 f值測(cè)定結(jié)果

式中Ci為內(nèi)標(biāo)物濃度，Ai為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為組分s濃度，As為組分s峰面積）[7-8]。

4.2 相對(duì)保留時(shí)間（RT）的確定

RT指各待測(cè)成分與內(nèi)參物間保留時(shí)間的比值。結(jié)果表明待測(cè)組分間的RT值波動(dòng)較小（RSD＜5 %），因此在缺乏對(duì)照品的情況下，利用RT值，并根據(jù)內(nèi)參物的保留時(shí)間，結(jié)合色譜峰的紫外吸收特征，能比較準(zhǔn)確合理地確定目標(biāo)成分的位置。結(jié)果見表5。

表5 RT值的測(cè)定結(jié)果

4.3 系統(tǒng)適用性考察

4.3.1 色譜柱對(duì)f的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜儀，分別考察3種不同品牌的色譜柱對(duì)f值的影響，結(jié)果見表6。由表6可見，毒黃素與內(nèi)參物米酵菌酸f值重現(xiàn)性較差（RSD＞5 %）。

表6 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

4.3.2 儀器對(duì)f的影響 采用Uitimate?UHPLC AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分別考察3種不同高效液相色譜儀對(duì)f的影響結(jié)果，結(jié)果見表7。由表7可見，毒黃素與內(nèi)參物米酵菌酸f重現(xiàn)性較差（RSD＞5 %）。

表7 不同儀器對(duì)f值的影響

4.3.3 流速、柱溫、波長(zhǎng)對(duì)f的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜儀和Uitimate?UHPLC AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分別考察3種不同流速（0.9，1.0，1.1 ml/min）、不同柱溫（25，30，35 ℃）及不同波長(zhǎng)微小變化（波長(zhǎng)分別為255，258，260 nm）對(duì)f的影響，結(jié)果見表8。由表8可見，這3個(gè)條件對(duì)毒黃素與內(nèi)參物米酵菌酸f影響較小，重現(xiàn)性良好（RSD＜5 %）。

表8 不同色譜條件對(duì)f值的影響

4.4 QAMS待測(cè)色譜峰的定位

試驗(yàn)中分別考察了米酵菌酸和毒黃素2種成分間RT值在3個(gè)不同型號(hào)的高效液相色譜儀和3種不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性，見表9。結(jié)果顯示，RT值變化較大（RSD＞5 %），重現(xiàn)性較差。

表9 待測(cè)色譜峰的RT值

5 討論

本試驗(yàn)以濕米粉為例，通過方法學(xué)驗(yàn)證、方法的耐用性、系統(tǒng)適用性考察，探討應(yīng)用QAMS檢測(cè)椰毒假單胞菌酵米面亞種兩種代謝產(chǎn)物毒黃素和米酵菌酸的可行性。試驗(yàn)中對(duì)不同液相色譜儀、不同色譜柱、不同流速、不同柱溫和不同波長(zhǎng)對(duì)f的影響進(jìn)行考察。其中不同液相色譜儀與不同色譜柱使f變化大，重現(xiàn)性差，RT值不穩(wěn)定。結(jié)果表明，QAMS在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性，不適用于毒黃素與米酵菌酸的測(cè)定。其原因可能有以下幾點(diǎn)。

5.1 化合物類型（母核）不同

據(jù)相關(guān)研究，QAMS應(yīng)用于同類型化合物（母核相同、僅僅是取代基的差異）的同時(shí)測(cè)定是完全沒有問題的，而對(duì)于不同類型的化合物，現(xiàn)有研究結(jié)果尚無(wú)法得出確定性的結(jié)論[9]。不同類型化合物的基本母核不一樣，導(dǎo)致其紫外吸收不同。米酵菌酸是一種脂溶性酸性化合物，分子式 C28H38O7，相對(duì)分子質(zhì)量486.61, 化學(xué)名為3-羧甲基-17-甲氧基-6, 8, 21-三甲基二十二碳-2, 4, 8, 12, 14, 18, 20-七烯二酸[10]，結(jié)構(gòu)見圖1。毒黃素為水溶性黃色素，分子式為 C7H7N5O2，相對(duì)分子質(zhì)量193.21 ，化學(xué)名1, 6-二甲基-5, 7-二氧-1, 5, 6, 7-四氫嘧啶基（5,4e）非對(duì)稱三嗪，結(jié)構(gòu)見圖2。二者基本母核不同。

圖1 米酵菌酸結(jié)構(gòu)

圖2 毒黃素結(jié)構(gòu)

研究報(bào)道表明，QAMS多應(yīng)用于中藥成分含量研究，食品領(lǐng)域研究報(bào)道較少，且多集中在保健食品方面[9]。QAMS應(yīng)用于同類型化合物的測(cè)定被證實(shí)是完全可行的，但對(duì)于不同類型的化合物，尚有待進(jìn)一步的研究，其應(yīng)用具有一定的局限性[11]。

據(jù)分析，目前報(bào)道的QAMS法，主要針對(duì)紫外共軛吸收強(qiáng)的多酚類化合物，使用HPLC/UV或UPLC/UV進(jìn)行測(cè)定，但在食品中還有大量紫外吸收弱、甚至無(wú)吸收的化合物[9]。本試驗(yàn)中雖然毒黃素分子結(jié)構(gòu)中含若干共軛鍵，但米酵菌酸分子多是單鍵連接，紫外吸收較弱，無(wú)法與毒黃素在紫外吸收峰面積上構(gòu)成正比關(guān)系，進(jìn)而導(dǎo)致其f值的不穩(wěn)定，在不同系統(tǒng)中存在較大差異。

本研究對(duì)GB 5009.189-2016[12]條件進(jìn)行優(yōu)化，所建方法可有效解決樣品中雜質(zhì)干擾的問題，并可實(shí)現(xiàn)毒黃素和米酵菌酸的有效分離。在此基礎(chǔ)上建立食品中毒黃素和米酵菌酸的QAMS測(cè)定方法，但在更換液相色譜儀條件下，f值及RT值重現(xiàn)性較差，難以實(shí)現(xiàn)以米酵菌酸為參照物，對(duì)食品中毒黃素含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。更優(yōu)化的方法有待進(jìn)一步研究探討。