李甜甜，林意雯，王飛*，李亞會，李積華，權喬鳳，韓志萍

（1.中國熱帶農業(yè)科學院 農產品加工研究所，廣東 湛江 524001；2.華中農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430000；3.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東 湛江 524001；4.海南省種子總站，海南 ?？?570100；5.嶺南師范學院，廣東 湛江 524001）

辣椒紅素是存在于紅辣椒中的一種天然類胡蘿卜素，是類胡蘿卜素合成途徑終端產物，是脂溶性天然色素，極易溶于植物油和乙醇[1-3]。辣椒紅素分子式為C40H56O3，化學結構為8-甲基-N-香草基-6-壬烯基，結構式見圖1。辣椒紅素屬共軛多烯烴含氧衍生物，通常是一種具有辣椒香氣味的深紅色黏性油狀液體，純辣椒紅素是深胭脂紅色針狀結晶體，較易溶于有機溶劑，不溶于水和甘油[4-5]。作為一種天然紅色素，辣椒紅素具有很高的生理活性，憑借色澤鮮艷、著色力強、熱穩(wěn)定性好、無任何毒害作用、安全性高等特性被廣泛應用于食品、飲料、保健藥品、化妝品等領域[6-7]。優(yōu)化辣椒紅素提取工藝不僅能提高辣椒附加值，也能促進深加工產業(yè)化生產。辣椒紅素是目前國際上公認最好的紅色素，被聯合國糧食與農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為A類食用色素，在使用中不加以限量[8-10]。

圖1 辣椒紅素結構圖Fig.1 The chemical structure of capsanthin from red chilli

辣椒紅素提取工藝有油溶法、有機溶劑法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法、亞臨界流體萃取法、超臨界CO2流體萃取法等[11-12]。目前有機溶劑提取、單酶提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界CO2流體萃取的研究較成熟，但復合酶提取和亞臨界流體萃取辣椒紅素鮮有研究。

本文選用新疆焉耆干紅辣椒為原料，采用有機溶劑法、超聲輔助法、酶輔助法和亞臨界流體萃取法4種工藝提取辣椒紅素，以色價和得率為評價指標，對4種提取工藝進行對比分析，闡明不同提取工藝對色價和得率的影響機制，以期為辣椒紅素深加工和產業(yè)化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆焉耆干紅辣椒：市售，去籽干燥，粉碎過20目篩備用；正己烷、正丁烷、乙酸乙酯、95%乙醇、丙酮（分析純）：廣州光華科技股份有限公司；纖維素酶（酶活力≥50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

紫外可見分光光度計（UV1780）：日本島津公司；電熱鼓風箱（WGLL-230BE）：吳江超宇烘箱制造有限公司；真空冷凍干燥機（ALPHA 2-4）、旋轉蒸發(fā)儀（LR4002）：德國CHRIST公司；多功能粉碎機（FLBP-1000A）：上海非力博食品機械有限公司；恒溫振蕩箱（ZD-85）：蘇州國華儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-S8）：常州普天儀器制造有限公司；超聲波清洗機（G-020）：深圳市歌能清洗設備有限公司；亞臨界流體萃取儀（CBE-5L）：中國農業(yè)科學院油料作物研究所；高速離心機（GT16-3）：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最長吸收波長及最佳有機溶劑的選擇

稱取10.0 g辣椒粉，分別采用95%乙醇、乙酸乙酯、正己烷作為提取溶劑，設定液料比 5∶1（mL/g），在60℃條件提取1 h，抽濾后取濾液，通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮至質量恒定的辣椒紅素粗產品并回收溶劑，采用紫外可見分光光度計測定吸光度，計算色價及得率。每組重復3次。

1.2.2 有機溶劑法提取辣椒紅素

稱取10.0 g辣椒粉，以正己烷為提取溶劑，以色價和得率為評價指標，采用單因素試驗優(yōu)化提取工藝參數，分別考察液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）]、提取溫度（20、40、60、70 ℃）、提取時間（1、2、3、4 h）對色價及得率的影響。

1.2.3 超聲輔助法提取辣椒紅素

稱取10.0 g辣椒粉，以正己烷為提取溶劑，以色價和得率為評價指標，在超聲功率100 W條件下采用單因素試驗優(yōu)化提取工藝參數，分別考察了液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）]、超聲溫度（30、40、50、60 ℃）、超聲時間（20、40、60、80 min）對色價及得率的影響。

1.2.4 酶法輔助提取辣椒紅素

稱取10.0 g辣椒粉，移至50 mL纖維素酶溶液中，在一定溫度下進行酶解。酶解后在100℃沸水中進行滅酶15 min后離心10 min（離心轉速5 000 r/min），去上清液后得到辣椒粉酶解產物，按超聲輔助最優(yōu)條件進行提取。提取后抽濾，取濾液采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至質量恒定的辣椒紅素粗產品并回收溶劑，測定吸光度，計算色價及得率。采用單因素試驗優(yōu)化提取工藝參數，分別考察酶添加量（0%、0.1%、0.3%、0.5%）、酶解時間（1、2、3、4 h）、酶解溫度（25、30、35、40、45 ℃）對色價及得率的影響。

1.2.5 亞臨界流體萃取辣椒紅素

采用CBE-5L型亞臨界設備萃取辣椒紅素，設定工藝參數：萃取劑正丁烷、萃取溫度45℃、萃取壓力0.38MPa、液料比 8∶1（mL/g）、萃取時間 1h。稱取 300.0g辣椒粉置于網兜中，系口后置入萃取罐中，加蓋密封。將萃取系統(tǒng)升溫至45℃時抽真空，抽真空后導入2.4 L正丁烷，靜態(tài)浸泡萃取1 h。萃取結束后將萃取液置于分離罐中，然后與萃取罐隔離，開啟壓縮機分別對兩罐進行減壓和溶劑回收。當兩罐中絕對壓力降至0.15MPa以下時，開啟真空泵與壓縮機串聯工作，直至兩罐絕對壓力降為0.01 MPa后，脫溶結束。從分離罐底部取出萃取辣椒紅素粗產品，稱量并記錄，置于4℃冰箱中保存，計算色價及得率。

1.3 辣椒紅素的檢測方法

1.3.1 標準曲線的建立

準確稱取0.005g辣椒紅素標準品，精確至0.0001 g，用丙酮稀釋定容在1 mL離心管中，配成濃度為0.5 mg/mL的辣椒紅素標準品溶液。精密吸取上述標準溶液0.001、0.002 、0.004、0.006、0.008 mL 分別置于 1 mL 離心管中，用丙酮定容至刻度，搖勻，放置l0 min，以0號管（丙酮）為參照，于460 nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標、辣椒紅素濃度為橫坐標，繪制標準曲線[13-14]，見圖2。根據試驗結果，得到辣椒紅素的標準曲線，回歸方程為y=5.458 9x+0.007 6，相關系數R2=0.996 4，該方法線性關系良好。

圖2 辣椒紅素標準曲線Fig.2 Standard curve of capsanthin

1.3.2 樣品中辣椒紅素色價的測定

色價是考察辣椒紅素的重要指標[15]，按照GB 1886.34—2015《食品安全國家標準食品添加劑辣椒紅》規(guī)定的方法采用紫外可見分光光度計測定辣椒紅素色價。準確稱取0.1 g試樣，精確至0.000 1 g，用丙酮稀釋于100 mL容量瓶中，再精確吸取稀釋溶液10mL，稀釋至100mL，在波長460 nm下，以丙酮作參比液，于1 cm比色皿中測定其吸光度。使用以下公式計算。

1.3.3 樣品中辣椒紅素得率的測定

準確稱取干燥辣椒紅素粗品約0.01 g，精確至0.000 1 g，用丙酮稀釋定容于10 mL容量瓶中，定容后不斷振蕩約10 min。精確吸取定容好的辣椒紅素粗品溶液1 mL置于10 mL的容量瓶中定容，搖勻。用紫外分光光度計于460 nm處測定吸光值，丙酮作參比液，根據標準曲線得出粗制辣椒紅素的濃度，再計算出其中的辣椒紅素得率[16]，公式如下。

式中：X表示辣椒紅素得率，%；m1表示辣椒紅素質量，g；m2表示辣椒粉質量，g。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.1軟件進行數據處理和圖表的制作。

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長及最佳有機溶劑的選擇

辣椒紅素主要由弱極性組分組成，而提取主要集中在對弱極性組分的研究。根據相似相溶原理，試驗采用95%乙醇、正己烷、乙酸乙酯等有機溶劑作為提取試劑分別提取辣椒紅素，測定不同波長下溶液吸光度，結果見圖3。

圖3 不同提取溶劑對辣椒紅素吸光度的影響Fig.3 Influence of different extraction solvents on the absorbance of capsanthin

如圖3所示，3種提取溶劑均在460 nm處有最大的吸光度，因此辣椒紅素的最大吸收波長為460 nm。在此波長測定誤差最小。

為考察不同提取溶劑對提取得到的辣椒紅素的色價和得率的影響，以95%乙醇、正己烷和乙酸乙酯3種不同溶劑作為探討對象，不同溶劑提取辣椒紅素的色價和得率的試驗結果見表1，不同提取溶劑提取辣椒紅素粗提物見圖4。

由表1和圖4可知，95%乙醇提取液渾濁，提取得率為0.91%，高于正己烷和乙酸乙酯，但在460 nm處的色價卻最低。提取液渾濁，是由于蛋白質及果膠等物質的存在導致色價降低。正己烷的濾液比乙酸乙酯濾液澄清，同時提取產物的色價和得率也優(yōu)于乙酸乙酯，其色價和得率分別為49.4、0.85%。另一方面，在溶劑回收過程中，正己烷的沸點（68℃）相對較低，消耗的回收熱能較少，因此最佳提取溶劑選擇正己烷。

圖4 不同提取溶劑提取辣椒紅素粗提物Fig.4 Extraction of capsanthin extracted with different solvents

表1 不同溶劑提取辣椒紅素的色價和得率Table 1 Color value and yield of capsanthin extracted with different solvents

2.2 有機溶劑法提取辣椒紅素工藝優(yōu)化

2.2.1 提取溫度對辣椒紅素提取效果影響研究

不同提取溫度對辣椒紅素提取的影響如圖5所示。

圖5 不同提取溫度對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.5 Effect of different temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖5可知，辣椒紅素的色價和得率隨著溫度的升高先升高后降低，當溫度達到60℃時，色價和得率達到最大值，分別為68.20、1.23%，繼續(xù)升溫，其色價和得率開始下降。主要是因為提取過程中溫度升高，分子運動速度加快使有機溶劑提取的辣椒紅素增多。當溫度持續(xù)升高，一些雜質也會溶解于有機溶劑中，導致辣椒紅素的濃度降低，并且溫度過高會導致辣椒紅素的降解，性質改變，從而使辣椒紅素的色價和得率降低。因此，辣椒紅素的最佳提取溫度為60℃。

2.2.2 提取時間對辣椒紅素提取效果影響研究

不同時間處理對辣椒紅素提取的影響如圖6所示。

圖6 不同提取時間對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.6 Effect of different time on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖6可知，辣椒紅素的色價和得率隨著提取時間的延長先上升后下降。當提取時間為3 h時，其色價和得率達到最高，分別為68.20、1.22%。3 h后隨著提取時間的延長，其色價和得率開始下降。主要是因為隨著時間的延長，辣椒紅素逐漸溶解于提取液中，含量逐漸增加，濃度上升導致色價和得率提高。但當時間過長則會使其他物質慢慢溶解于溶液中，導致辣椒紅素色價和得率降低。因此辣椒紅素的最佳提取時間為3 h。

2.2.3 液料比對辣椒紅素提取效果影響研究

不同液料比對辣椒紅素提取的影響如圖7所示。

圖7 不同液料比對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.7 Effect of different ratio of material on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖7可知，辣椒紅素的色價和得率隨著液料比的升高呈現先上升后下降的趨勢。當液料比為5∶1（mL/g）時，其色價和得率達到最高值，分別為53.73、0.97%。高于 5∶1（mL/g）時，辣椒紅素的得率逐漸下降，色價降低。這種趨勢主要是因為隨液料比的增加，辣椒紅素含量增加，提取液中其濃度也隨之增加，使辣椒紅素的色價和得率升高。液料比過大會引起其他雜質溶出干擾辣椒紅素的純度致使提取得到的辣椒紅素的色價和得率下降。因此辣椒紅素的最佳液料比選擇5∶1（mL/g）。

2.3 超聲輔助法提取辣椒紅素工藝優(yōu)化

2.3.1 超聲時間對辣椒紅素提取效果影響研究

在超聲溫度和液料比相同的條件下，研究超聲時間對辣椒紅素提取效果的影響，影響結果如圖8所示。

圖8 不同超聲時間對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.8 Effect of different time on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖8可知，隨著時間的延長，辣椒紅素的色價和得率不斷增大，在超聲時間為60 min時，提取得到的辣椒紅素的色價和得率達到最高，分別為83.77、1.54%；但繼續(xù)延長超聲時間，辣椒紅素的色價和得率開始下降。主要因為一定的超聲時間破壞了細胞壁，使辣椒紅素更易于溶出；但超聲時間過長會導致細胞內的辣椒紅素凝集成團，使辣椒紅素的溶出率降低，同時也會使辣椒紅素發(fā)生降解。因此，超聲提取辣椒紅素的最佳提取時間為60 min。

2.3.2 超聲溫度對辣椒紅素提取效果影響研究

在超聲時間和液料比相同的條件下，研究超聲溫度對辣椒紅素提取效果的影響，結果如圖9所示。

圖9 不同超聲溫度對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.9 Effect of different temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖9可知，超聲溫度為30℃～40℃時，提取得到的辣椒紅素的色價和得率差距不大，辣椒紅素的得率及色價隨溫度的升高而增大，在超聲溫度為50℃時達到最高，色價和得率分別為111.53、2.06%。溫度繼續(xù)升高，提取的辣椒紅素的色價和得率呈下降趨勢。主要因為適當的超聲溫度有助于辣椒紅素的溶解；但當溫度過高時，會導致溶劑的揮發(fā)從而使辣椒紅素不能完全溶出。因此，超聲提取辣椒紅素的最佳溫度為50℃。

2.3.3 液料比對辣椒紅素提取效果影響研究

在超聲時間和超聲溫度相同的條件下，液料比對辣椒紅素提取效果的影響結果如圖10所示。

圖10 不同液料比對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.10 Effect of different ratio of material on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖10可知，隨液料比的增大，辣椒紅素的色價和得率先上升后下降，液料比為5∶1（mL/g）時色價和得率達到最高值，分別為110.21、2.01%，而當液料比高于5∶1（mL/g）時，辣椒紅素的色價和得率下降。主要因為合適的液料比有利于辣椒紅素的浸提，當加入的有機溶劑過多則會使其它雜質溶解，影響辣椒紅素濃度。因此，超聲提取辣椒紅素的最佳液料比為5∶1（mL/g）。

2.4 酶法輔助提取辣椒紅素工藝優(yōu)化

2.4.1 酶添加量對辣椒紅素提取效果影響研究

在酶解時間和酶解溫度一定的條件下，酶添加量對辣椒紅素提取效果影響結果如圖11所示。

由圖11可知，隨著纖維素酶添加量的增大，提取得到的辣椒紅素的色價和得率呈先上升后下降的趨勢，在酶添加量為0.3%時，辣椒紅素的色價和得率達到最高值，繼續(xù)增加酶添加量辣椒紅素的色價和得率慢慢下降。主要是因為在一定條件下，酶添加量低于最佳值時，酶解反應未進行完全，底物過量，致使辣椒紅素色價不高，得到的辣椒紅素也不多，達到最佳值時，酶解反應進行得比較徹底，而再增加酶添加量時影響不明顯，呈現平緩趨勢。因此，纖維素酶的最佳酶添加量為0.3%，在此條件下提取得到的辣椒紅素的色價和得率分別為49.91、0.91%。

圖11 酶添加量對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.11 Effect of enzyme dosage ratio on the color value and yield of extracted capsanthin

2.4.2 酶解溫度對辣椒紅素提取效果影響研究

在酶解時間和酶添加量一定的條件下，酶解溫度對辣椒紅素提取效果影響結果如圖12所示。

由圖12可知，纖維素酶酶解溫度在25℃～35℃時，辣椒紅素色價和得率隨酶解溫度增加而增大，在35℃時達到最大值，提取得到的辣椒紅素的色價和得率分別為42.13、0.76%，35℃后隨酶解溫度的增大而急劇下降。主要是因為一定的酶解溫度可以加速酶解反應，但當溫度過高時則會促使酶活性變性，影響辣椒紅素的提取效果。因此，纖維素酶最佳酶解溫度是35℃。

圖12 酶解溫度對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.12 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

2.4.3 酶解時間對辣椒紅素提取效果影響

在酶添加量和酶解溫度一定的條件下，酶解時間對辣椒紅素提取效果影響結果如圖13所示。

圖13 酶解時間對辣椒紅素色價和得率的影響Fig.13 Effect of enzymatic hydrolysis time on the color value and yield of extracted capsanthin

由圖13可知，纖維素酶提取得到的辣椒紅素的色價和得率隨酶解時間的增加先升高后降低，3 h時達到最大值，3 h后開始下降。主要是因為在一定時間內，酶活力得到了充分利用，使酶解反應進行得比較完全，但當酶解時間過長，會造成一部分的辣椒紅素分解。因此，纖維素酶最佳酶解時間是3 h。

2.5 亞臨界流體萃取辣椒紅素

亞臨界流體萃取對極性物質具有強的溶解能力，同時擴散系數大、黏度系數小，在液態(tài)和臨界點附近具有良好的溶解性能。亞臨界流體萃取辣椒紅素結果見表2。

表2 亞臨界流體萃取辣椒紅素的色價和得率Table 2 Color value and yield of subcritical fluid extraction of capsanthin

由表2可知，萃取劑為正丁烷、萃取溫度45℃、萃取壓力 0.38 MPa、液料比 8∶1（mL/g）、萃取時間 1 h 的萃取條件下，辣椒紅素的色價和得率分別為124.26，2.23%，與其它3種方法相比，亞臨界流體的色價和得率最高。主要是因為亞臨界流體萃取保留了有效成分的營養(yǎng)價值，從而提高了有效成分的提取率。

2.6 不同提取工藝對辣椒紅素得率和色價的影響及比較

不同提取工藝獲得辣椒紅素得率和色價結果比較見表3。

從表3可知，4種提取工藝提取得到的辣椒紅素的色價和得率有一定差異性，其中亞臨界流體萃取得到的辣椒紅素的色價和得率最高，分別為124.26，2.23%。這是由于亞臨界流體萃取技術充分利用亞臨界狀態(tài)正丁烷分子與辣椒粉發(fā)生的分子擴散作用，萃取辣椒紅素相對完全，同時該過程在室溫25℃或低溫條件下進行，避免物料中的熱敏性成分破壞。超聲波輔助加快了辣椒紅素在溶劑中的擴散作用，最大限度破壞細胞壁將辣椒紅素溶出。相比較傳統(tǒng)有機溶劑法和纖維素酶輔助，亞臨界流體萃取和超聲波輔助法提取效率更高，提取得到的辣椒紅素色價更高。考慮到實際生產成本，超聲波輔助提取工藝更加符合辣椒紅素產業(yè)化生產的需求。

表3 不同提取工藝獲得辣椒紅素色價和得率結果比較Table 3 Comparison of different extraction conditions on the color value and yieldof extracted capsanthin

3 結論

本文通過有機溶劑法、超聲輔助法、酶提取法、亞臨界流體萃取法4種提取方法提取辣椒紅素，并對4種提取方法提取得到的色價和得率進行了比較。結果表明，亞臨界流體萃取法和超聲輔助提取法提取效果要優(yōu)于有機溶劑法和酶輔助提取工藝，其色價分別為124.26和113.20，得率分別為2.23%和2.06%，這是由于亞臨界流體萃取充分利用亞臨界狀態(tài)正丁烷分子與辣椒粉發(fā)生的分子擴散作用，使辣椒紅素萃取得相對完全，同時該過程在室溫25℃或低溫條件下進行，避免物料中的熱敏性成分破壞。超聲波輔助加快了辣椒紅素在溶劑中的擴散作用，最大限度地破壞細胞壁使辣椒紅素溶出?？紤]到實際生產設備及成本，超聲波輔助提取工藝更加符合辣椒紅素產業(yè)化生產。