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載脫鈣骨基質(zhì)的3D打印多孔生物陶瓷的制備及其成骨性能研究*

2021-12-22 13:02張鐵胡麗蔡志祥杜小青閆飛飛王志勇張旗蔡林
生物骨科材料與臨床研究 2021年6期
關(guān)鍵詞:骨組織成骨磷酸

張鐵 胡麗 蔡志祥 杜小青 閆飛飛 王志勇 張旗* 蔡林

3D 打印作為新興的材料制造技術(shù),由于其獨特的成型優(yōu)勢,在醫(yī)療行業(yè)有著不可替代的地位[1-2]。其中,選擇性激光燒結(jié)(selective laser sintering,SLS)技術(shù)已經(jīng)運用在金屬醫(yī)療器械的制造成型上,顯示出較傳統(tǒng)工藝更為滿意的結(jié)果[1-2]。常用的3D打印技術(shù)還有熔融沉積成型(fused deposition modeling,F(xiàn)DM)和立體光刻(stereolithography,SLA)技術(shù),其中SLA 具有更高的精度,能夠完成更為復(fù)雜的模型打印[3-6]。

傳統(tǒng)的生物陶瓷材料的主要成分為磷酸鈣和羥基磷灰石,該類陶瓷具有較好的生物相容性和力學(xué)性能,但是降解性能差,植入體內(nèi)后難以降解,阻礙新骨的形成[7-11]。但是通過3D 打印技術(shù)可以實現(xiàn)材料復(fù)雜的多孔結(jié)構(gòu),有利于骨組織的長入,同時多孔結(jié)構(gòu)會增加材料的比表面積,能夠加速其降解,進(jìn)而可以解決其降解能力差的缺點[1-2,4]。

硫酸鈣具有良好的降解能力和生物相容性,在臨床上具有廣泛的應(yīng)用[11-13]。但是在燒結(jié)過程中由于有機(jī)成分的存在,會降低其分解溫度,導(dǎo)致成型困難,故而難以應(yīng)用到SLA 技術(shù)中制備多孔生物陶瓷。同種異體骨,如脫鈣骨基質(zhì)(decalcified bone matrix,DBM),其天然微孔結(jié)構(gòu)有利于傳導(dǎo)成骨,同時富含骨形態(tài)發(fā)生蛋白等生長因子而具有誘導(dǎo)成骨能力,在臨床上顯示了良好的成骨能力[11,14-17]。為了保持其誘導(dǎo)能力,DBM 在加工過程中不能進(jìn)行高溫處理。

1 材料與方法

1.1 3D 打印多孔生物陶瓷的制備

將二水磷酸氫鈣(醫(yī)藥級,洛陽龍門藥業(yè)有限公司)、碳酸鈣(醫(yī)藥級,上海碳酸鈣廠)按照摩爾比2∶1 添加到球磨罐中,添加無水乙醇(醫(yī)藥級,新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司)和磨球,球磨2~5 h,在干燥箱中干燥至恒重后轉(zhuǎn)移到馬弗爐中高溫煅燒,冷卻后球磨,得到-磷酸三鈣粉料。

選用200~300 g 雄性SD 大鼠50 只[湖北省實驗動物研究中心提供,動物使用許可證號:SCXK(鄂)2008-0004],麻醉處死后取長管骨段壓碎后用手工磨粉器將其制作成骨粉,用分析篩篩選100~900m 的骨粉備用。10℃~12℃條件下,用乙醇復(fù)合溶劑進(jìn)行脫脂,磁力攪拌24 h,用純化水進(jìn)行反復(fù)震蕩沖洗40 min。用0.6 mol/L 的鹽酸對骨粉進(jìn)行脫鈣,磁力攪拌器持續(xù)攪拌24 h,更換鹽酸溶液后又脫鈣24 h。用純化水反復(fù)沖洗骨粉1 h。將所有骨粉同時進(jìn)行冷凍干燥24 h。

將DBM 添加到2%的羥丙甲纖維素(醫(yī)藥級,浙江中維藥業(yè)股份有限公司)溶液中,攪拌混合均勻,然后注射到3D 打印多孔生物陶瓷的孔道中,冷凍干燥,得到載DBM的多孔生物陶瓷。

1.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能研究

1.2.1 -磷酸三鈣理化性能表征

使用德國布魯克AXS 公司D8 Advance 型X 射線衍射分析儀對合成的-磷酸三鈣粉料的物相結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表征。XRD 分析條件:靶:Cu-Ka 射線(=0.154 06 nm),管壓:40 kV,管流:40 mA,2掃描范圍:10°~80°。

采用英國馬爾文儀器公司MS2000 型激光粒度分布儀進(jìn)行粒徑分析。

1.2.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能表征

利用美國Instron 公司萬能材料試驗機(jī)Instron 5967 測量抗壓強(qiáng)度,探頭加載速度為0.5 mm/min。

使用德國蔡司Zeiss Ultra Plus 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM,放大倍數(shù):12~1 000 000)對粉體和陶瓷微觀形貌進(jìn)行觀察,同時自帶配套能譜儀(EDS),用于分析測試樣品的元素組成。

按《中華人民共和國藥典》(第四部)中0821 重金屬檢查法進(jìn)行檢測樣品的重金屬總量。

1.3 細(xì)胞毒性

將細(xì)胞濃度為1.0×105個/mL 的細(xì)胞(L929)懸液按100L/孔接種于96 孔板,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。去除原培養(yǎng)液,用PBS 清洗3 遍,按照100L/孔分別加不同濃度的材料浸提液(浸提條件為:按照0.2 g/mL,在37℃下浸提24 h)與對照溶液,空白對照為MEM 培養(yǎng)液,陰性對照為含10%生理鹽水的MEM 培養(yǎng)液,陽性對照為含10%DMSO 的MEM 的培養(yǎng)液,每組設(shè)置6 個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng),分別于24 h、72 h 時觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.4 動物試驗

1.4.1 動物模型的制作與分組

3D 打印多孔生物陶瓷和載DBM 的3D 打印多孔生物陶瓷經(jīng)鈷60 滅菌(16~25 kGy)后備用。

健康8 周雄性SD 大鼠12 只(湖北省實驗動物研究中心提供),體量160~200 g。采用異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉,大鼠頭部剃毛后常規(guī)消毒鋪巾,在無菌條件下切開皮膚,切口長約1.5 cm,使用磨骨鉆造孔(6 mm),植入樣本材料,縫合筋膜皮膚,放回籠內(nèi)分開養(yǎng)殖,動物蘇醒后自由活動,正常喂食。手術(shù)后8 周處死動物,取植入物及其周圍的骨組織。3D-TCP 組:植入3D 打印多孔生物陶瓷,每組4 只;3D-TCP/DBM 組:植入載DBM 的3D 打印多孔生物陶瓷,每組4 只;空白組:不植入任何材料,每組4 只。

1.4.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定后,常規(guī)脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片,常規(guī)行HE 和Masson 染色,觀察組織學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用檢驗,<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 -磷酸三鈣的粒徑分布

圖2 -磷酸三鈣的XRD 圖譜

2.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能

在1 050℃、1 150℃、1 250℃和1 350℃條件下燒結(jié)的樣品的重金屬總量均<50 ppm。

3D 打印多孔生物陶瓷在1 050℃、1 150℃、1 250℃和1 350℃條件下燒結(jié)的樣品的抗壓強(qiáng)度分別為(8.57±2.10)MPa,(17.02±5.16)MPa,(19.35±2.94)MPa,(15.9±3.45)MPa,其中在1 250℃條件下燒結(jié)的樣品抗壓強(qiáng)度最高,在1 150℃、1 250℃和1 350℃條件下燒結(jié)的樣品與在1 050℃條件下燒結(jié)的樣品的抗壓強(qiáng)度比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3,<0.05)。

圖3 3D 打印多孔生物陶瓷在不同燒結(jié)溫度下的抗壓強(qiáng)度(*<0.05,**<0.01,***<0.001;n=6)

圖4 為3D打印多孔生物陶瓷在不同燒結(jié)溫度下的SEM圖和EDS 圖,從圖4 中可以看出,在1 050℃條件下燒結(jié),微觀結(jié)構(gòu)為明顯的顆粒狀;在1 150℃條件下燒結(jié),-磷酸三鈣顆粒連接為整體,存在一定的孔隙;在1 250℃條件下燒結(jié),-磷酸三鈣連接為致密的整體,存在少量的空隙;在1 350℃條件下燒結(jié),材料燒結(jié)為整體,但是可以看到顆粒之間存在明顯的界限,且孔隙較1 250℃條件下增多。所有條件下燒結(jié)的樣品表面均可觀察到分布均勻的Ca 和P,表觀Ca/P 為1.52±0.06。

圖4 3D 打印多孔生物陶瓷在不同燒結(jié)溫度下的SEM 圖(×5000)和EDS 圖

2.3 細(xì)胞毒性

培養(yǎng)24 h,空白組、3D-TCP 組和3D-TCP/DBM 組的OD 值分別為0.79、0.69 和0.70,得到3D-TCP 組和3D-TCP/DBM 組的存活率分別為87.3%和88.6%,大于GB/T 16886.5要求的70%,無細(xì)胞毒性;培養(yǎng)72 h,空白組、3D-TCP 組和3D-TCP/DBM 組的OD 值分別為1.48、1.11 和1.19,得到3D-TCP 組和3D-TCP/DBM 組的存活率分別為75.0%和80.4%,無細(xì)胞毒性。

圖5 3D 打印多孔生物陶瓷體的外細(xì)胞毒性評價

2.4 植入試驗

2.4.1 大體觀察

SD 大鼠均無死亡,活動、進(jìn)食情況正常,精神狀態(tài)無明顯變化。未見癱瘓、驚厥、呼吸抑制等不良反應(yīng)。傷口均愈合良好??瞻捉M骨缺損區(qū)域未見明顯減小,無明顯成骨(見圖6A1 和6A2)。3D-TCP 組:取材后,3D 打印多孔生物陶瓷與周圍骨組織融合,可見組織長入孔隙,未見材料明顯降解,形態(tài)未發(fā)生明顯改變(見圖6B1 和6B2)。3D-TCP/DBM 組:取材后,可誘導(dǎo)3D 打印多孔生物陶瓷與周圍骨組織融合,可見組織長入孔隙,中間孔隙DBM 形態(tài)發(fā)生改變,轉(zhuǎn)化為較硬的骨組織,并與-磷酸三鈣支架融合,未見支架明顯降解(見圖6C1 和6C2)。

圖6 3D 打印多孔生物陶瓷外觀形態(tài):A1、A2.空白組0 周和8 周時形態(tài);B1、B2.3D-TCP 組0 周和8 周時形態(tài);C1、C2.3D-TCP/DBM 組0 周和8 周時形態(tài)

2.4.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

圖7 為大鼠顱骨植入試驗8 周后取材HE 和Masson 染色結(jié)果??瞻捉M骨缺損界限清晰,無明顯骨組織生長,在骨缺損處可見少量新生血管(見圖7A 和圖7D)。3D-TCP 組可見大量-磷酸三鈣材料殘留,同時也能觀察到材料少量降解,在降解空隙中可見少量組織長入;同時可以觀察到,在材料孔隙中有大量的新生血管和骨組織生成,新生骨組織與3D打印多孔生物陶瓷緊密結(jié)合,沿著孔隙向內(nèi)生長(見圖7B和圖7E)。3D-TCP/DBM 組中同樣可見大量-磷酸三鈣材料殘留和少量材料降解,其中DBM 基本轉(zhuǎn)化為新生骨組織,可見大量骨細(xì)胞和骨髓生成,且融合為整體;DBM 轉(zhuǎn)化生成的新生骨組織占據(jù)整個中間孔隙,且向周圍孔隙生長,同時在周圍孔隙可見大量新生血管,骨組織生長于多孔生物陶瓷的孔隙中,且與多孔生物陶瓷緊密接觸(見圖7C和圖7F)。

圖7 SD 大鼠顱骨植入試驗的HE 和Masson 染色切片(術(shù)后8 周):A-C.空白組、3D-TCP 組和3D-TCP/DBM 組HE 染色;D-F.空白組、3D-TCP組和3D-TCP/DBM 組Masson 染色

3 討論

采用SLA 技術(shù)進(jìn)行3D 打印的優(yōu)點主要在于可實現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn),產(chǎn)品精度高,能夠設(shè)計復(fù)雜的內(nèi)部孔隙和外部結(jié)構(gòu),可進(jìn)行個性化定制,從而可以減輕患者痛苦,同時增加產(chǎn)品成骨能力[1-2]。而這些優(yōu)點都是建立在打印的粉料具有良好的生物相容性、足夠小的粒徑(<10m)和良好的熱穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上[2,4,6]。相比較羥基磷灰石,采用-磷酸三鈣作為打印粉料,主要是因為其具有良好的降解性能[9-11]。同時本文合成的-磷酸三鈣具有較高的純度,XRD 圖譜未觀察到任何雜質(zhì)峰,確保其良好的生物安全性,且粒徑小于10m,分布范圍窄,確保其打印精度,為個性化定制奠定基礎(chǔ)。從制備的植入材料外形可以看出,樣品具有均勻的孔隙結(jié)構(gòu),孔徑為0.5mm,外觀規(guī)整。

孔徑和孔連通率是影響骨傳導(dǎo)性能的關(guān)鍵因素,支架孔徑為300~500m 時,且具備高孔連通率時,有助于骨和血管的長入,具備良好的骨傳導(dǎo)作用,促進(jìn)成骨[18-19]。3D 打印多孔生物陶瓷為孔隙完全連通的多孔結(jié)構(gòu),多孔結(jié)構(gòu)會增加材料比表面積,同時材料由外到內(nèi)整體與體液接觸,在一定程度上會加快材料的降解速度;磷酸鈣降解過程中會釋放鈣離子和磷酸根離子,有助于類骨質(zhì)的鈣化,形成新骨[10]。負(fù)載DBM 時,由于其特殊的結(jié)構(gòu),使得DBM 充分暴露在體液環(huán)境中,有助于DBM 的分解,同時DBM 具備骨誘導(dǎo)能力,降解過程中會釋放BMP 等生長因子,自身逐漸被新骨替代,加之支架的骨傳導(dǎo)作用,內(nèi)外同時傳導(dǎo),加速骨愈合[13-15]。術(shù)后8 周,可以看到空白組無明顯骨組織生長,而3D-TCP 組有大量新骨和血管長入,血管的長入為新骨的生長提供了營養(yǎng)基礎(chǔ),且骨組織與材料結(jié)合緊密,體現(xiàn)了良好的骨傳導(dǎo)作用;3D-TCP/DBM 組中DBM 在沒有與骨組織接觸的情況下轉(zhuǎn)化為新骨,且新骨內(nèi)可見骨髓,體現(xiàn)DBM 具備骨誘導(dǎo)能力,并可見新骨向孔隙結(jié)構(gòu)中傳導(dǎo)的趨勢,實現(xiàn)了內(nèi)外共同傳導(dǎo)的目的;大部分-磷酸三鈣支架沒有降解,在前期支架可以起到骨傳導(dǎo)和提供鈣離子和磷酸根離子的作用,最后會被完全吸收,轉(zhuǎn)化為新骨。通過3D 打印多孔生物陶瓷和DBM的協(xié)同作用,達(dá)到前期快速成骨的目的,進(jìn)一步加快了骨愈合。

本研究制備的3D打印多孔生物陶瓷具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,在1 250℃條件下燒結(jié)力學(xué)性能更優(yōu),結(jié)構(gòu)更為致密,該多孔結(jié)構(gòu)有助于骨和血管的長入,實現(xiàn)材料的骨傳導(dǎo)作用;通過負(fù)載DBM,可實現(xiàn)骨的雙向傳導(dǎo),加速骨愈合。有待通過研究更多動物模型來進(jìn)一步研究3D 打印多孔生物陶瓷的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能。

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