蔣 楊，丘曉花，陳 博，鐘 平，劉 霞 （廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 523808）

半楓荷為金縷梅科半楓荷屬常綠喬木，是我國(guó)特有的單種屬植物，主要分布于中國(guó)南部和東南部山區(qū)，其根、莖、葉枝均可入藥，全年可采，曬干入藥，用于治療風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿疼痛、跌打損傷、刀傷出血等治療[1]。研究報(bào)道半楓荷根的醇提物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、活血化瘀的作用[2]。李云燕等[3]用自制半楓荷散治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有顯著療效。本研究分別采用水和乙醇兩種溶劑對(duì)半楓荷根進(jìn)行提取，采用熱板法、醋酸扭體法、足跖腫脹及耳腫脹法對(duì)小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎實(shí)驗(yàn)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明種清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄兼用。由廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（粵）2015-0147。

1.2 藥品與儀器

新鮮半楓荷根2020 年采自福建龍巖，系人工養(yǎng)殖樹(shù)種，采挖經(jīng)當(dāng)?shù)乜h人民政府野生植物主管部門(mén)同意，并經(jīng)我校林堅(jiān)濤研究員鑒定為正品，風(fēng)干、粉碎備用。阿司匹林腸溶片（蘇州弘森藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32025896）；1%角叉菜膠溶液（角叉菜膠批號(hào)YY13755，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司）；0.6%醋酸溶液（冰醋酸購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)20190906）；二甲苯（天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20190802），苦味酸，蒸餾水。YLS-6B 智能熱板儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司），YLS-7A足跖容積測(cè)量?jī)x（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海遠(yuǎn)懷實(shí)業(yè)有限公司），電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），大小鼠打孔器（北京創(chuàng)博生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 配藥[4]半楓荷水提物的制備：取粉碎好的生藥粉100 g，用10倍容積的蒸餾水浸泡24 h，煎煮3次，第1次為1 h，第2、3次均為0.5 h。濾過(guò)，合并藥液減壓濃縮，55 ℃干燥得到干浸膏，取相應(yīng)干膏用適量蒸餾水配成高(0.2 g/mL)、中(0.15 g/mL)、低（0.1 g/mL）3 個(gè)濃度的水提物。半楓荷乙醇提物的制備：100 g生藥粉加乙醇回流3次（80%乙醇5倍量，1.5 h；70%乙醇4倍量，1.5 h；50%乙醇3倍量，1.5 h），濾過(guò)，減壓回收乙醇，濃縮液水浴65 ℃蒸干，后置于真空55 ℃干燥得到干浸膏，用適量酒精溶解后，用蒸餾水配成高(0.2 g/mL)、中(0.15 g/mL)、低(0.1 g/mL)3 個(gè)濃度醇提物。取阿司匹林片（25 mg/片）20 片，研磨成粉末，加蒸餾水溶解至100 mL，制成5 g/L的阿司匹林混懸液。

1.3.2 分組與給藥 取64只小鼠，隨機(jī)分成8組，即對(duì)照組(生理鹽水溶液0.1 mL/10 g)，陽(yáng)性對(duì)照組(5 g/L阿司匹林混懸液)，半楓荷水提物低(0.1 g/mL)、中(0.15 g/mL)、高(0.2 g/mL)劑量組，半楓荷乙醇提物低(0.1 g/mL)、中(0.15 g/mL)、高(0.2 g/mL)劑量組，每組8 只。給藥方式：每天灌胃1次，連續(xù)給藥1周。

1.3.3 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)[5]以小鼠舔后足作為痛反應(yīng)指標(biāo)，選取痛閾值10～30 s范圍內(nèi)的雌性小鼠按“1.3.2”項(xiàng)下分組，給藥前分別進(jìn)行2 次測(cè)定其痛閾值，取平均值作為小鼠給藥前的痛閾值。最后一次灌胃1 h 后，取小鼠置熱板儀內(nèi)（55.0±0.5）℃，室溫（20.0±1.0）℃，記錄各組小鼠第l次舔后足時(shí)間，測(cè)定各組痛閾值，以60 s 為限，若超過(guò)60 s 者，以60 s 計(jì)算。計(jì)算各組痛閾提高百分率，痛閾提高百分率=[(用藥后痛閾值-用藥前痛閾值)/(用藥前痛閾值)]×100%。

1.3.4 扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)[6]每只小鼠于末次給藥1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸10 mL/kg，記錄10 min 內(nèi)小鼠腹部?jī)?nèi)凹、軀干扭曲、臀部抬高、后肢伸長(zhǎng)等扭體反應(yīng)的次數(shù)。抑制率=（對(duì)照組扭體反應(yīng)次數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)）/對(duì)照組扭體反應(yīng)次數(shù)×100%。

1.3.5 足趾腫脹實(shí)驗(yàn)[7]每只小鼠于末次給藥1 h后，分別在小鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠生理鹽水溶液0.05 mL 致炎，致炎1 h 后分別容積法測(cè)量小鼠右后足跖的體積。足跖腫脹度=（右足跖體積-左足跖體積）/左足跖體積×100%，足跖腫脹抑制率=（對(duì)照組足跖腫脹度-給藥組足跖腫脹度）/對(duì)照組足跖腫脹度×100%。

1.3.6 耳腫脹實(shí)驗(yàn)[8]每只小鼠于末次給藥1 h 后，用二甲苯（0.03 mL）均勻涂于各小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)，30 min 后脫頸處死小鼠，沿著小鼠耳廓剪下雙耳，用打孔器分別在左右耳打下同一部位的相同大小的耳片，置天平稱(chēng)重，以?xún)啥馁|(zhì)量差作為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。腫脹抑制率=[(對(duì)照組耳片腫脹度-給藥組耳片腫脹度)]/對(duì)照組耳片腫脹度×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)熱板法致小鼠疼痛的影響

給藥后，與對(duì)照組比較，半楓荷乙醇提物對(duì)小鼠痛閾值與痛閾提高百分率明顯升高，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對(duì)小鼠的痛閾值與痛閾提高百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)小鼠熱板法致痛的鎮(zhèn)痛作用 (，n=8)

表1 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)小鼠熱板法致痛的鎮(zhèn)痛作用 (，n=8)

與對(duì)照組比較：aP<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.2 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

給藥后，與對(duì)照組比較，半楓荷水、乙醇提物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均明顯減少，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，半楓荷乙醇提物中、高劑量組對(duì)小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)與抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響(，n=8)

表2 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響(，n=8)

與對(duì)照組比較：aP<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.3 對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響

給藥后，與對(duì)照組比較，半楓荷水、乙醇提物對(duì)角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹度明顯下降，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對(duì)角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹度與腫脹抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(，n=8)

表3 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(，n=8)

與對(duì)照組比較：aP<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.4 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

給藥后，與對(duì)照組比較，半楓荷水、乙醇提物對(duì)角叉菜膠所致小鼠的耳腫脹明顯下降，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對(duì)角叉菜膠所致小鼠的耳腫脹度與腫脹抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(，n=8)

表4 半楓荷水、乙醇提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(，n=8)

與對(duì)照組比較：aP<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

3 討論

半楓荷作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的臨床用藥歷史和確切的療效，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，是一類(lèi)具有較大開(kāi)發(fā)價(jià)值的植物群[9]。近幾年對(duì)半楓荷的研究主要集中在從根、莖、葉中分離出酸類(lèi)、醇類(lèi)及胡蘿卜苷等有效成分，顯示其具有抗炎、抗病毒、活血化瘀等作用[10]。楊武亮等[11]對(duì)半荷根的醇提物對(duì)鼠的鎮(zhèn)痛和抗炎作用進(jìn)行研究，其結(jié)果表明半楓荷根的醇提物具有輕度的鎮(zhèn)痛作用，且具有很好的抗炎作用。梁偉江等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同極性半楓荷提取物對(duì)血瘀模型大鼠均有活血化瘀的作用，但效果最明顯的是半楓荷提取物的水提物。孫靜等[13]用從半楓荷中提取的不同藥物組分作用于乙型肝炎細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)半楓荷對(duì)病毒性肝炎的抗原具有抑制活性，其抗肝炎病毒活性成分主要為齊墩果酸。廖娜等[14]研究結(jié)果顯示金縷半楓荷多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)常見(jiàn)的菌種具有明顯的抑菌效果，顯示較廣的抗菌譜。目前對(duì)于半楓荷的開(kāi)發(fā)利用研究，需要解決的主要問(wèn)題是半楓荷不同部位的有效活性成分及其作用機(jī)理不明確，各種成分是單獨(dú)起作用，還是相互起作用尚不清楚[15]。

本研究分別用水和乙醇兩種溶劑對(duì)半楓荷根進(jìn)行提取，對(duì)半楓荷水、醇提物的鎮(zhèn)痛、抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明，半楓荷乙醇提物高、中劑量均延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值，痛閾提高百分率大于50%，對(duì)熱板法引起的物理致痛具有鎮(zhèn)痛作用，且有劑量依賴(lài)性。而半楓荷水提物高、中、低劑量組之間的痛閾提高百分率均小于50%，對(duì)熱板法引起的物理致痛沒(méi)有鎮(zhèn)痛作用。對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響結(jié)果顯示，半楓荷水、乙醇提取物對(duì)小鼠的扭體反應(yīng)均有抑制作用，以半楓荷乙醇提物高、中劑量的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)100%，表明半楓荷這兩種提取物對(duì)醋酸引起的化學(xué)致痛均有鎮(zhèn)痛作用，可能是因?yàn)榇姿嵋鹦∈筇弁捶磻?yīng)的同時(shí)還伴有炎癥反應(yīng)，醋酸可引起化學(xué)遞質(zhì)如前列腺素E2、組胺和腹膜內(nèi)血清素的增加，導(dǎo)致血管通透性增加。半楓荷水提物可能是通過(guò)對(duì)抗炎反應(yīng)而起到一定的鎮(zhèn)痛作用。半楓荷水、乙醇提物對(duì)角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹和二甲苯所致耳腫脹均有抑制作用，且腫脹抑制率與劑量呈依賴(lài)性，且以半楓荷乙醇提物效果較好。二甲苯誘導(dǎo)耳腫脹和角叉菜膠引起的足跖腫脹可能與某些化學(xué)物質(zhì)像組胺、5-羥色胺、緩激肽、P 物質(zhì)和前列腺素等誘發(fā)的神經(jīng)源性水腫相關(guān)，結(jié)果顯示兩種提取物均具有顯著的抗炎活性，尤其是在炎癥的急性期[16-18]。半楓荷水提物和醇提物中有效成分可能既有相同部分，又有差異，其具體成分和發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的具體機(jī)制有待下一步研究。