張敏 成利花 殷曉桐 羅好 蔡成

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/上海市兒童醫(yī)院新生兒科，上海 200062）

多種因素導(dǎo)致支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的發(fā)生，目前已知與早產(chǎn)的相關(guān)性最強(qiáng)，肺泡發(fā)育受損是BPD的典型特征，但尚不清楚其具體的分子機(jī)制［1］。BPD 的病理過(guò)程包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。Kuwasako 等［2］于 1993 年從人體嗜鉻細(xì)胞瘤中分離并提取腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM），ADM 是一種血管活性多肽。ADM 具有舒張血管、利尿、排鉀、拮抗腎上腺素系統(tǒng)及抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移增殖等生物學(xué)作用［3］。肺是合成和代謝ADM 的主要場(chǎng)所，主要由平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷逐漸增加，ADM 的含量逐漸減少［4］。ADM 主要通過(guò)降鈣素受體樣受體（calcitonin receptor-like receptor，CRLR）發(fā)揮作用，而受體活性修飾蛋白（receptor activity-modifying proteins，RAMP） 1、2、3 會(huì)改變 CRLR 的反應(yīng)性和親和力［5］。例如 CRLR/RAMP1 形成 CGRP-I 或 CGRP-II應(yīng)答細(xì)胞；RAMP2 或RAMP3 與CRLR 共同表達(dá)時(shí)可激發(fā)ADM 的反應(yīng)性［6］。有研究通過(guò)新生小鼠實(shí)驗(yàn)證明，小鼠生后14 d 左右ADM、CRLR 及RAMP2 的表達(dá)量最多［7］。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated kinase，ERK）能將多種細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)到核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞形態(tài)的維持［7］。ADM主要通過(guò)ERK1/2信號(hào)途徑誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其生長(zhǎng)和存活，進(jìn)而改善肺部血管的生成［8］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，PKB 通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、抗凋亡和維持代謝穩(wěn)態(tài)等過(guò)程［9-10］。Kim 等［11］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜上，ADM 與CRLR/RAMP2 或CRLR/RAMP3 受體結(jié)合，激活PKB 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成。

ERK/PKB 信號(hào)通路是 ADM 在 BPD 中發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵通路，而ERK/PKB作為ADM通路下游的指標(biāo)，在激活細(xì)胞增殖、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但具體的分子機(jī)制至今仍未完全闡明。假設(shè)ERK 和PKB 的表達(dá)受ADM 調(diào)控，就能深入了解ADM、ERK、PKB 在BPD 發(fā)生發(fā)展中的防御機(jī)制，為早產(chǎn)兒BPD 的防治提供新的理論依據(jù)及策略方向。故本研究旨在通過(guò)高氧暴露、沉默ADM 的表達(dá)探討ERK 及PKB在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary micro‐vascular endothelial cells，HPMEC）中的表達(dá)變化，為早產(chǎn)兒BPD 的發(fā)病機(jī)制與臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

HPMEC［8，12-14］由 美 國(guó) 模 式 培 養(yǎng) 物 集 存 庫(kù)（American type culture collection，ATCC）提供，產(chǎn)品目錄號(hào)：CRL-3244。ADM 小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和ADM 陰性對(duì)照siRNA 由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó) Life Technology 公司，TRIzol Reagent 購(gòu) 自 美 國(guó) Ambion 公 司 ，PrimeScriptTMRT reagent Kit （for real time） 及SYBR?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus） 均購(gòu)自日本TAKARA公司。

1.2 HPMEC高氧暴露模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

將HPMEC接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，待HPMEC在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)至接近融合狀態(tài)時(shí)，隨機(jī)分為空氣組和高氧組。空氣組仍置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；高氧組將貼壁純化后的細(xì)胞加入新培養(yǎng)液后置于3 L/min 92%O2+5%CO2高純混合氣中培養(yǎng)［15-17］，24 h后立即用封口膠密封培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通氧前后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)用CYS-1數(shù)字式測(cè)氧儀檢測(cè)培養(yǎng)瓶中氧濃度，低于90%的標(biāo)本棄去。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，在24 孔板中，每孔加入500 μL無(wú)抗完全培養(yǎng)基并接種0.5×105～2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用250 μL無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1.5 μg 質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸3～5次混勻。輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用250 μL無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋5.0 μL LipofectamineTM2000，輕輕吹吸3～5 次混勻，室溫下靜置5 min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20 min。培養(yǎng)板上的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加入不含血清和抗生素的DMEM 培養(yǎng)基500 μL，每孔細(xì)胞加上述500 μL 轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA 混合液，輕輕搖晃混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h。取出培養(yǎng)板，小心吸去每孔液體后，加1 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。可在熒光顯鏡下觀察和進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 驗(yàn)證siRNA抑制ADM效果及可能機(jī)制

將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和ADM siRNA組，空白對(duì)照組未施加任何處理，陰性對(duì)照組和ADM siRNA 組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ADM 陰性對(duì)照siRNA 和 ADM siRNA 后，檢測(cè) ADM mRNA 及其蛋白的表達(dá)水平，觀察siRNA對(duì)ADM的抑制效果。

將細(xì)胞分為未干擾組和干擾組，未干擾組未施加任何處理，干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ADM siRNA 后，檢測(cè)ADM、ERK1/2、PKB 的mRNA 及其蛋白表達(dá)水平。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平

收集各組HPMEC，經(jīng)不同的實(shí)驗(yàn)條件處理后，采用TRIzol 法根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行總RNA 的提取和鑒定。0.2 mL RNase free EP管中配制混合液，冰上操作。37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 60 min 得到的cDNA 加入180 μL ddH2O 稀釋備用?？芍苯佑糜?nd-strand cDNA 的合成或PCR 擴(kuò)增，-20℃保存。PCR 擴(kuò)增時(shí)cDNA 的推薦最大使用量為原液1 μL。PCR管中配制PCR反應(yīng)混合液，冰上操作?；靹颍總€(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40～45個(gè)循環(huán)；解離曲線95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s；上機(jī)擴(kuò)增檢測(cè)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞蛋白抽提及定量、SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)顯像均按照試劑操作說(shuō)明書進(jìn)行。新鮮配制封閉液：在TBST 中加入脫脂奶粉至終濃度為5%（w/v），封閉時(shí)，將膜浸入到封閉液中，室溫下振蕩1 h；加入稀釋好的一抗抗體，4℃過(guò)夜；TBST洗膜3次（每次5 min）；加入稀釋好的二抗抗體 （1∶5 000），室溫1 h 振蕩孵育；TBST 洗膜3次（每次5 min）。洗好膜以后，取出ECL發(fā)光試劑，取適量各溶液混合，將膜放入曝光儀器中，滴加發(fā)光液，曝光3次，每次5 min，選擇3次曝光的重疊值。蛋白表達(dá)結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空氣組和高氧組中ADM及其相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)

與空氣組相比，高氧組ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2、PKB 的mRNA 及其蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2～3和圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè)空氣組和高氧組蛋白表達(dá)電泳圖

表2 空氣組和高氧組ADM及其相關(guān)信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)比較 （）

表2 空氣組和高氧組ADM及其相關(guān)信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)比較 （）

注：［ADM］腎上腺髓質(zhì)素；［CRLR］降鈣素受體樣受體；［RAMP2］受體活性修飾蛋白2；［ERK］細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；［PKB］蛋白激酶B。

images/BZ_99_237_2840_496_2903.pngPKB 1.02±0.15 1.43±0.32-3.489 0.003 3 3images/BZ_99_496_2840_642_2903.pngimages/BZ_99_642_2840_962_2903.pngimages/BZ_99_962_2840_1282_2903.pngimages/BZ_99_1282_2840_1602_2903.pngimages/BZ_99_1602_2840_1923_2903.pngimages/BZ_99_237_3021_496_3139.png空氣組高氧組images/BZ_99_496_3021_642_3139.pngimages/BZ_99_642_3021_962_3139.png1.01±0.07 3.54±0.27images/BZ_99_962_3021_1282_3139.png1.00±0.05 1.91±0.21images/BZ_99_1282_3021_1602_3139.png1.00±0.09 2.47±0.17images/BZ_99_1602_3021_1923_3139.png1.03±0.05 3.38±0.38

表3 空氣組和高氧組ADM及其相關(guān)信號(hào)通路分子的蛋白表達(dá)比較 （）

表3 空氣組和高氧組ADM及其相關(guān)信號(hào)通路分子的蛋白表達(dá)比較 （）

注：［ADM］腎上腺髓質(zhì)素；［CRLR］降鈣素受體樣受體；［RAMP2］受體活性修飾蛋白2；［ERK］細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；［PKB］蛋白激酶B。

images/BZ_100_237_414_455_476.pngPKB 0.920±0.010 2.000±0.010-135.824＜0.001 3 3images/BZ_100_455_414_596_476.pngimages/BZ_100_596_414_926_476.pngimages/BZ_100_926_414_1255_476.pngimages/BZ_100_1255_414_1584_476.pngimages/BZ_100_1584_414_1914_476.pngimages/BZ_100_237_594_455_712.png空氣組高氧組images/BZ_100_455_594_596_712.pngimages/BZ_100_596_594_926_712.png0.548±0.007 1.532±0.028images/BZ_100_926_594_1255_712.png0.728±0.008 0.948±0.007images/BZ_100_1255_594_1584_712.png0.308±0.007 0.469±0.008images/BZ_100_1584_594_1914_712.png0.248±0.007 0.757±0.007

2.2 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、ADM siRNA 組ADM表達(dá)變化

空白對(duì)照組（1.026±0.067）、陰性對(duì)照組（1.082±0.090）、 ADM siRNA 組 （0.158±0.019）ADMmRNA 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=561.702，P＜0.001）；空白對(duì)照組（1.088±0.091）、陰性對(duì)照組 （0.969±0.078）、 ADM siRNA 組 （0.554±0.069） ADM 蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.998，P＜0.001）。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，ADM siRNA 組ADMmRNA 及其蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Western blot 法檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、ADM siRNA組ADM 蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 未干擾組和干擾組ADM、ERK1/2 及PKB 表達(dá)變化

與未干擾組相比，干擾組ADM、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）。見表4～5和圖3。

表4 未干擾組和干擾組ADM、ERK及PKB的mRNA表達(dá)比較 （）

表4 未干擾組和干擾組ADM、ERK及PKB的mRNA表達(dá)比較 （）

注：［ADM］腎上腺髓質(zhì)素；［ERK］細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；［PKB］蛋白激酶B。

1.00±0.07 0.47±0.09images/BZ_100_1284_1432_1469_1495.pngimages/BZ_100_1469_1432_1541_1495.pngimages/BZ_100_1541_1432_1775_1495.png3 3images/BZ_100_1775_1432_2009_1495.pngimages/BZ_100_2009_1432_2243_1495.pngimages/BZ_100_1284_1613_1469_1731.png未干擾組干擾組images/BZ_100_1469_1613_1541_1731.pngimages/BZ_100_1541_1613_1775_1731.png1.01±0.09 0.18±0.04images/BZ_100_1775_1613_2009_1731.png1.02±0.17 0.41±0.08images/BZ_100_2009_1613_2243_1731.png

表5 未干擾組和干擾組ADM、ERK及PKB的蛋白表達(dá)比較 （）

表5 未干擾組和干擾組ADM、ERK及PKB的蛋白表達(dá)比較 （）

注：［ADM］腎上腺髓質(zhì)素；［ERK］細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；［PKB］蛋白激酶B。

1.023±0.029 0.879±0.009images/BZ_100_1284_2043_1469_2105.pngimages/BZ_100_1469_2043_1541_2105.pngimages/BZ_100_1541_2043_1775_2105.png3 3images/BZ_100_1775_2043_2009_2105.pngimages/BZ_100_2009_2043_2243_2105.pngimages/BZ_100_1284_2223_1469_2341.png未干擾組干擾組images/BZ_100_1469_2223_1541_2341.pngimages/BZ_100_1541_2223_1775_2341.png2.118±0.007 0.907±0.006images/BZ_100_1775_2223_2009_2341.png0.559±0.009 0.507±0.006images/BZ_100_2009_2223_2243_2341.png

圖3 Western blot 法檢測(cè)未干擾組和干擾組ADM、ERK及PKB蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，氧療已成為治療早產(chǎn)兒的關(guān)鍵措施。氧氣作為一種環(huán)境刺激，在肺的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。但長(zhǎng)期暴露于高氧環(huán)境會(huì)影響肺的發(fā)育，造成不可逆的損傷。目前BPD 發(fā)病率逐年增加。相關(guān)研究表明多種原因?qū)е翨PD的發(fā)生，但主要是活性氧（reactive oxy‐gen species，ROS） 和高氧環(huán)境的共同作用［18］，肺泡和肺部血管生長(zhǎng)停滯是BPD 的主要特征［19］。Wang 等［18］指出患有 BPD 的早產(chǎn)兒預(yù)后較差，呼吸道感染的概率大且再次入院率高，視網(wǎng)膜病變、學(xué)習(xí)障礙和高血壓的風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較高；另外隨著年齡的增長(zhǎng)，肺功能會(huì)逐漸下降。

本研究以高氧暴露下HPMEC 為細(xì)胞模型研究對(duì)象，研究中選用高氧暴露作為誘導(dǎo)損傷，這與大多數(shù)住院早產(chǎn)兒生后需要氧療相一致。目前永生化的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelialtypeⅡcell，AECⅡ）尚未建立，原代培養(yǎng)的AECⅡ不穩(wěn)定，并不適合進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。人類HPMEC 是從人類肺組織中分離的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，保留了內(nèi)皮細(xì)胞的許多特征。內(nèi)皮細(xì)胞可介導(dǎo)血液和組織之間的相互作用，在血管生成、血流調(diào)節(jié)、血管通透性、傷口愈合、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［20］。因此本研究選擇HPMEC為研究對(duì)象，其原因是：（1）其增殖和成熟在肺泡的形成及肺的生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用；（2）其功能障礙與BPD 發(fā)病密切相關(guān)；（3）ADM 及其信號(hào)受體在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富［8］。

RNA干擾是一種進(jìn)化保守的過(guò)程，在轉(zhuǎn)錄后，特定基因的表達(dá)被一種siRNA抑制，siRNA識(shí)別互補(bǔ)mRNA 并誘導(dǎo)其降解。目前，RNA 干擾被廣泛用于抑制特定基因的表達(dá)，以達(dá)到實(shí)驗(yàn)和治療的目的。在本研究中，暴露在高氧環(huán)境中ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表達(dá)顯著增加；用siRNA 抑制ADM 后，ERK1/2與PKB的mRNA及其蛋白表達(dá)均顯著下降；由此推測(cè)ERK1/2、PKB 可能為ADM 信號(hào)通路下游靶點(diǎn)，共同參與BPD的保護(hù)過(guò)程。

在本細(xì)胞研究模型中，與空氣組相比，高氧組 ADM、CRLR 及 RAMP2 的 mRNA 及其蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)；與未干擾組相比，干擾組ADM mRNA 及其蛋白表達(dá)均明顯下降。ADM 主要通過(guò)CRLR發(fā)揮作用，而RAMP2可改變CRLR的反應(yīng)性和親和力［6］。類似地，Menon 等學(xué)者［8］分別于生后3、7、14、28 d 取空氣呼吸（常氧）小鼠肺組織發(fā)現(xiàn)，ADM 在生后14 d 的表達(dá)水平最高；然后將1日齡的野生型小鼠隨機(jī)分為兩組，分別暴露在常氧或高氧中14 d，高氧組小鼠在空氣中恢復(fù)14 d，恢復(fù)期后在生后28 d檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高氧暴露小鼠的徑向肺泡計(jì)數(shù)顯著降低，平均線性截距顯著升高，表明與常氧暴露小鼠相比，高氧暴露小鼠肺泡數(shù)量減少，直徑增大。上述結(jié)果表明高氧可刺激ADM 的產(chǎn)生，并且ADM 的受體CRLR 和受體活性修飾蛋白R(shí)AMP2表達(dá)相應(yīng)升高，提示ADM參與高氧誘導(dǎo)肺損傷的過(guò)程，并可能通過(guò)改善肺泡的形成在高氧肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

在本研究中，高氧組中ERK 的mRNA 及其蛋白表達(dá)均明顯高于空氣組；用siRNA 抑制ADM 表達(dá)后，ERK 的mRNA 及其蛋白表達(dá)均明顯下降；ERK1/2與ADM的表達(dá)大致呈正相關(guān)。ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)是傳遞細(xì)胞外因子信號(hào)的中樞通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期等過(guò)程［21］。類似地，Semplicini 等［22］發(fā)現(xiàn) ADM 可刺激腎上腺球狀帶細(xì)胞中ERK1和ERK2的磷酸化、顯著增加ERKs的活性，從而增強(qiáng)大鼠腎上腺球狀帶細(xì)胞的增殖。也有研究發(fā)現(xiàn)ADM 通過(guò)激活MAPK/ERK 下游信號(hào)通路，可能是由于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1誘導(dǎo)CRLR基因的表達(dá)，直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存［23］。在腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞（786-0）轉(zhuǎn)染ADM siRNA 后，ADM 的表達(dá)水平顯著降低，且細(xì)胞增殖能力、體外遷移和侵襲能力均受抑制；ADM 可顯著提高786-0 細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）水平，用不同濃度ADM 處理786-0細(xì)胞后，p-ERK1/2水平無(wú)顯著差異，但當(dāng)用ADM 受體拮抗劑（ADM22-52）或MAPK 抑制劑（PD98059） 阻斷 ADM-ERK 通路時(shí)，p-ERK1/2 表達(dá)降低［24］。綜上所述，在兩種不同的實(shí)驗(yàn)條件下，ADM 與ERK 的表達(dá)趨勢(shì)均一致，由此我們推測(cè)高氧可刺激ADM 的產(chǎn)生，ADM 靶向于ERK 信號(hào)通路，通過(guò)激活ERK1/2 后在高氧肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

在本研究中，暴露在高氧環(huán)境下，PKB 的mRNA 及其蛋白表達(dá)均升高，且PKB 與ADM 的表達(dá)大致呈正相關(guān)；與未干擾組相比，干擾組PKB的mRNA及其蛋白表達(dá)均明顯下降。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）及其下游靶向激酶PKB 在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。PKB 通過(guò)磷酸化和調(diào)節(jié)其他激酶、轉(zhuǎn)錄因子和其他細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白的功能來(lái)影響細(xì)胞的活性［25］。Nishimatsu 等［26］發(fā)現(xiàn) ADM 以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式誘導(dǎo)PKB 磷酸化，這種磷酸化是Ca2+/鈣調(diào)蛋白通路介導(dǎo)的，而PI3K/PKB 通路在血管內(nèi)皮中發(fā)揮維持血管張力、減少細(xì)胞凋亡及死亡、修復(fù)內(nèi)皮和調(diào)節(jié)血管生成等多種生物學(xué)作用。但Gao等［24］發(fā)現(xiàn)用ADM 處理786-0 細(xì)胞后，磷酸化PKB水平未顯著升高。大量研究表明轉(zhuǎn)錄因子核因子-E2 相關(guān)因子 2 （nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）/抗 氧 化 反 應(yīng) 元 件 （antioxidant response element，ARE）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路，而PI3K/PKB 通路在Nrf2 的磷酸化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［27-29］。由此推測(cè)Nrf2/ARE 信號(hào)通路可能參與ADM 保護(hù)高氧肺損傷的過(guò)程，但尚不清楚其具體機(jī)制。綜上所述，PKB 與ADM 的表達(dá)大致呈正相關(guān)，我們由此推測(cè)高氧環(huán)境中會(huì)增加ADM的產(chǎn)生，而ADM 靶向于PKB 信號(hào)通路，通過(guò)激活PKB 后在BPD中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，高氧誘導(dǎo)BPD 的發(fā)生，ADM 是機(jī)體一種重要的活性肽，ERK/PKB 作為ADM 通路下游的靶點(diǎn)，ADM 可能通過(guò)調(diào)控CRLR/RAMP2 介導(dǎo)ERK/PKB 信號(hào)通路，在激活細(xì)胞增殖、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，從而對(duì)BPD發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究仍存在部分局限性，雖然ADM與ERK/PKB 信號(hào)通路存在正向調(diào)節(jié)作用，但我們尚未完全闡明其正向調(diào)控作用的具體機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究探討。