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耐砷A216T 錯義突變型PML-RARα 質(zhì)粒的構(gòu)建及雄黃對其蛋白產(chǎn)物影響及機制

2021-12-26 01:58潘一鳴李蕊白黃子明費明明陳凌燕
中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年33期
關(guān)鍵詞:錯義質(zhì)粒測序

潘一鳴 李蕊白 黃子明 劉 宇 費明明 陳凌燕 侯 麗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科,北京 100700;2.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325035

急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia,APL)患者超過90%表現(xiàn)為t(15;17)(q22;q12),產(chǎn)生PML-RARα 融合基因,導(dǎo)致APL 發(fā)生[1]。維甲酸和三氧化二砷靶向PML-RARα 使APL 變得可治愈[2]。但10%的APL 患者在治療后無法獲得長期生存,耐藥復(fù)發(fā)是主要原因[3]。耐砷APL 患者PML-RARα 存在錯義突變,如A216T 等導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變引起耐藥[4-7]。為研究這一問題,本研究構(gòu)建了A216T 突變的PML-RARα 質(zhì)粒(以下簡稱PMLA216T-RARα,野生型簡稱為PMLWT-RARα),并研究了砷劑雄黃對其的影響和相關(guān)機制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑

砷劑雄黃(純度≥99%,湖北信康醫(yī)藥化工有限公司,12279-90-2)。引物委托北京擎科生物科技有限公司合成;pCDH-puro 質(zhì)粒由溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存;Trizol Reagent(Life Technology,B610409-0100);2×Phanta Max Master Mix(Vazyme,P525-01);Plasmid Mini Kit(OMEGA,D6943-01);Gel Extraction Kit(OMEGA,NA1111-1KT)。無縫克隆試劑盒[和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司,M2026];Lipo fectamineTM3000(Thermo Fisher,L3000015);PML 抗體(ab96051)、P62 抗體(ab56416)、LC3B 抗體(ab192890)、p-mTOR 抗體(ab109268)、β-actin(ab8226)均購于abcam 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HL-60 細胞由中國科學(xué)院上海細胞庫提供,用含10% FBS 的IMDM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。95D 和A549 細胞為實驗室凍存細胞,分別用含10%的FBS的DMEM 和含10%的FBS 的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻獲得PML 與RARα 的mRNA 序列及其融合位點,設(shè)計引物。95D、A549 細胞用Trizol 法提取總RNA,擬轉(zhuǎn)錄為cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增目的基因,PML 正向引物:5’-AGAAGATTCTAGAGCTAGGCCACCATGGAGCCTGCACCCGCCCG-3’,反向引物:5’-GCTCTGGGTCTCAATGGTTGCCTCCCCGGCGCCACTG-3’。RARα 正向引物:5’-ACCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTT-3’,反向引物:5’-CGGATCCGATTTAAATTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGGGGAGTGGGTGGCCG-3’。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳后用Gel Extraction Kit 回收分別獲得PML 與RARα 的片段。設(shè)計插入突變用的引物,PMLA216T正向引物:5’-TGCTCGTGCACGCTCCTTGAC-3’,反向引物:5’-AAGGAGCGTGCACGAGCAG-3’。以PML 的cDNA 為模板,用PML 正向和PMLA216T反向引物先進行1 次PCR 反應(yīng),再用PML 反向和PMLA216T正向引物進行第二次PCR 反應(yīng),將兩次PCR 的產(chǎn)物用無縫克隆試劑盒按說明書行無縫克隆,即可獲得PMLA216T片段,再將其與RARα、單酶切后得載體pCDH-puro 用無縫克隆連接即完成質(zhì)粒構(gòu)建。產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 按說明書操作用LipofectamineTM3000 將pCDH-puro-PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα轉(zhuǎn)染至HL-60 細胞,轉(zhuǎn)染24 h 后開始相關(guān)實驗。

1.2.4 血清饑餓和雄黃對PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響 HL-60 細胞轉(zhuǎn)染后,用不同濃度的雄黃處理24 h,收集細胞制樣,Western blot 觀察PML-RARα 和自噬相關(guān)因子的變化。細胞轉(zhuǎn)染24 h 后用含0、5%、10% FBS 的IMDM培養(yǎng)基處理24 h,Western blot 觀察PML-RARα 和自噬相關(guān)因子的變化。Western blot 步驟:濃縮膠80 V 30 min,分離膠120 V 60 min,轉(zhuǎn)膜100 V 120 min,封閉1.5 h,一抗4℃孵育過夜,二抗孵育1 h,曝光顯影。Western blot 結(jié)果用Image J 進行灰度值相對定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差()表示,兩組間比較用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒測序結(jié)果

PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα 與已知序列完全符合,其中PMLA216T-RARα 的PML 部分的第216 個密碼子所對應(yīng)的3 個堿基由GCG 變成ACG,相應(yīng)的氨基酸由丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T),突變點位測序結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2 不同濃度雄黃對PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα的影響

予0.5、1、2、4、8 μmol/L 雄黃處理24 h,結(jié)果顯示:1、2、4、8 μmol/L 雄黃處理后PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理(0 μmol/L)的PMLWTRARα 和PMLA216T-RARα 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);0.5 μmol/L 雄黃處理后PMLWT-RARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理的PMLWT-RARα 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。相同濃度雄黃處理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖2。

圖2 Western blot 檢測不同濃度雄黃處理后對PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα 的影響

2.3 血清饑餓對PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

5% FBS 和未經(jīng)FBS 處理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平低于10% FBS 處理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平,p62、LC3B 水平高于10% FBS 處理的p62、LC3B 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖3。

圖3 血清饑餓對PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

2.4 不同濃度雄黃對PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

予0、4、8、16、32、64 μmol/L 雄黃處理24 h,結(jié)果顯 示:4、8、16、32、64 μmol/L 雄黃處理后PMLA216TRARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理的PMLA216T-RARα 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);8、16、32、64 μmol/L雄黃處理后p-mTOR、p62 水平低于未經(jīng)雄黃處理的p-mTOR、p62 水平,LC3B 水平高于未經(jīng)雄黃處理的LC3B 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);16 μmol/L雄黃處理后p-mTOR、p62 水平低于8 μmol/L 雄黃處理后的p-mTOR、p62 水平,LC3B 水平高于8 μmol/L雄黃處理后的LC3B 水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖4。

圖4 不同濃度雄黃對PMLA216T-RARα 及自噬相關(guān)因子的影響

3 討論

PML-RARα 蛋白會使白血病干細胞分化停滯、凋亡抵抗,進行持續(xù)自我更新發(fā)展為APL[8]。維甲酸和三氧化二砷通過靶向PML-RARα 使APL 從高度致死性疾病變成了高度可治愈的疾病[9-12]。以雄黃為主要成分的砷劑復(fù)方黃黛片在APL 治療上被證明不劣于三氧化二砷,還具有口服方便、經(jīng)濟的特點[13-16]。近來臨床上發(fā)現(xiàn)部分APL 患者砷劑耐藥,該類患者的PML-RARα 中PML 部分發(fā)生了錯義突變,如A216V、A216T、S214L、L217F、S220G 等,這改變了砷結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致耐藥[4-7]。

p-mTOR 是自噬負調(diào)控因子,下調(diào)該因子會促進自噬。LC3B 參與自噬體的組裝,其水平的高低或LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ的比例是檢測自噬的通用指標。p62 是一種與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激、自噬相關(guān)的蛋白,常在應(yīng)激、自噬時升高,同時p62 是一種自噬接頭蛋白,通過自身將底物和自噬囊泡上的LC3B 連接,并一起被消化降解,可用來區(qū)分非選擇性或是選擇性自噬[17-19]。

研究結(jié)果顯示PMLA216T-RARα 對雄黃存在耐藥。有研究顯示自噬可以降解PMLWT-RARα[20],通過血清饑餓可以使PMLA216T-RARα 水平下降,提示自噬可以降解突變的PMLA216T-RARα。雄黃濃度超過16 μmol/L后,PMLA216T-RARα 下降明顯,伴有p-mTOR 水平下降和LC3B 水平升高,顯示自噬增強,且p62 水平下降,提示增加藥物濃度可以克服耐藥,而16 μmol/L 及更高濃度的雄黃下調(diào)PMLA216T-RARα 水平可能是通過選擇性自噬發(fā)揮作用的。此外,本研究注意到PMLA216TRARα 條帶的上方有一陪行的條帶,趨勢和PMLA216TRARα 一致,推測可能是PMLA216T-RARα 的某種聚合體,有待于免疫熒光定位和免疫共沉淀等驗證。

既往研究顯示,相比正常成熟粒細胞,APL 細胞自噬相關(guān)蛋白低表達[21-22],敲除自噬基因Atg7、Atg8后小鼠發(fā)生白血病[23];用全反式維甲酸和三氧化二砷治療APL 后,自噬相關(guān)通路激活,而阻斷自噬會降低療效[24-25]。結(jié)合本研究結(jié)果,我們認為自噬相關(guān)的因子是PML-RARα 錯義突變相關(guān)耐藥問題的潛在靶點,此外提高雄黃濃度也可以克服錯義突變相關(guān)耐藥,但如何在更低劑量情況做到這一點需要進一步研究。

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