秦小妹 郭帥杰 李 悅 李思耐 劉衛(wèi)紅 王旭昀 劉紅旭 周明學▲

1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)男科，北京 100010；3.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科，北京 100010

腦血栓是常見的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率等特點，且臨床預后差[1-2]。中醫(yī)治療腦血栓具有致殘率低、急性期患者生存質(zhì)量高、毒副作用小、治療花費低等優(yōu)點[3-4]。氣虛血瘀是腦血栓急性期的主要病機[5-6]，參元益氣活血膠囊（以下簡稱“參元丹膠囊”）是首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科劉紅旭主任研發(fā)的以益氣逐瘀為治法的院內(nèi)制劑，在臨床用于治療氣虛血瘀型不穩(wěn)定型心絞痛[7-8]。中醫(yī)腦心同治理論認為，氣虛血瘀是腦血栓和冠心病共同的病因病機，但該藥用于治療腦血栓的研究目前還未見相關報道。近年來，斑馬魚模型因其可視性強、觀察方便、成本低和周期短等優(yōu)勢，在藥理藥效學研究中應用逐漸增多[9-11]。因此，為了給參元丹膠囊新的臨床應用適應證提供實驗學依據(jù)，本研究采用普納替尼誘導斑馬魚腦血栓評價參元丹膠囊治療腦血栓的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚，年齡為受精后2 d，共720 尾，以自然成對交配繁殖方式進行養(yǎng)殖，飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導率為450～550 μS/cm；pH 為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3）[12]，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC 認證的要求。

1.2 實驗藥物

參元丹膠囊（批號：Z20053327）由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，按照臨床等效劑量換算，用蒸餾水配制成20 mg/ml 母液；普納替尼（批號：13771）購于美國MCE 公司，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成20 mg/ml 的母液；阿司匹林（批號：J1910024）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用DMSO 配制成50 mg/ml 的母液。所有母液置于-20℃保存，按需稀釋。

1.3 實驗儀器和試劑

體式顯微鏡（SZX7，OLYMPUS）；六孔板（Nest Biotech）；96 孔板（NestBiotech）；精密電子天平[MS105DU/A，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，精密度0.01 mg]；行為分析儀（Zebra Lab 3.11，ViewPoint）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon）；吖啶橙染料（批號：494-38-2，Sigma）；甲基纖維素（批號：079K0054V，Sigma）；DMSO（批號：BCBZ1685，Sigma）。

1.4 腦血栓斑馬魚模型的建立

采用1.5 μg/ml 普納替尼處理斑馬魚18 h，建立斑馬魚腦血栓模型[13]。在顯微鏡下觀察，拍照，統(tǒng)計形成腦血栓的斑馬魚數(shù)目，并采用行為分析儀測定斑馬魚運動軌跡和速度，綜合評價腦血栓斑馬魚模型建立與否。

1.5 實驗分組與處理

1.5.1 藥物對腦血栓斑馬魚的改善功效評價 選取180 尾斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾，容量為3 ml，分為6 組，正常對照組，模型組，陽性對照組，參元丹膠囊高、中、低劑量組，分別予養(yǎng)魚用水，普納替尼（1.5 μg/ml），普納替尼（1.5 μg/ml）同時水溶給予阿司匹林（50 μg/ml）或參元丹膠囊（500.0、167.0、55.6 μg/ml）18 h 后，每組選取20 尾在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計形成腦血栓的斑馬魚數(shù)目，計算每組斑馬魚腦血栓的發(fā)生率。腦血栓發(fā)生率=斑馬魚腦血栓數(shù)目/斑馬魚數(shù)目[13]，記為I；腦血栓改善功效=I（模型組）-I（給藥組）/I（模型組）×100%[13]。參元丹膠囊濃度確定依據(jù)：根據(jù)本課題組前期濃度摸索預實驗結果，參元丹膠囊改善腦血栓功效最大耐受濃度為500 μg/ml，所以最終將參元丹膠囊實驗濃度設置為55.6、167.0 和500.0 μg/ml。

1.5.2 藥物對腦血栓斑馬魚的行為學改善功效評價選取180 尾斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組及各組斑馬魚干預方法同“1.5.1”項下，每組選取20 尾斑馬魚應用行為分析儀測定斑馬魚運動速度（V）。藥物對腦血栓的運動速度改善功效計算公式如下：運動速度改善功效=V（給藥組）-V（模型組）/V（模型組）×100%[13]。

1.5.3 藥物對腦血栓的斑馬魚血流速度改善功效評價選取180 尾斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組和各組斑馬魚干預方法同“1.5.1”項下，每組選取20 尾斑馬魚置于心跳血流分析軟件下錄制斑馬魚血流視頻，分析斑馬魚血流速度（S）。藥物對腦血栓的血流速度改善功效計算公式如下：血流速度改善功效=S（給藥組）－S（模型組）/S（模型組）×100%[13]。

1.5.4 藥物對腦血栓的斑馬魚腦部細胞凋亡抑制功效評價 選取180 尾斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組和各組斑馬魚干預方法同“1.5.1”項下，用吖啶橙進行染色，染色后每組選取20 尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，利用NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件進行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計斑馬魚腦部細胞凋亡數(shù)（N）。藥物對腦血栓的腦部細胞凋亡抑制功效計算公式如下：腦部細胞凋亡抑制功效=N（模型組）-N（給藥組）/N（模型組）×100%[13]。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s t-檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；多組率的兩兩比較采用Bonferroni方法校正。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的改善功效評價

與正常對照組比較，模型組斑馬魚腦血栓發(fā)生率明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚腦血栓發(fā)生率明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.017）。參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚腦血栓發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。參元丹膠囊高劑量組腦血栓改善功效為55%，參元丹膠囊中劑量組腦血栓改善功效為45%。見表1、圖1。

表1 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的改善功效評價（n=20）

圖1 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的影響（5.6×）

2.2 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的行為學改善功效評價

與正常對照組比較，模型組斑馬魚運動速度明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚運動速度明顯提高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低劑量組比較，參元丹膠囊中、高劑量組斑馬魚運動速度明顯提高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊中劑量組運動速度改善功效為49%，參元丹膠囊高劑量組運動速度改善功效為47%。見表2、圖2。

表2 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的行為學改善功效評價（n=20）

圖2 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的行為學改善功效軌跡圖

2.3 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的血流速度改善功效評價

與正常對照組比較，模型組斑馬魚血流速度明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊中、高劑量組斑馬魚血流速度明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低、中劑量組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚血流速度升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊高劑量組血流速度改善功效為32%。見表3。

表3 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚的血流速度改善功效評價（n=20）

2.4 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚腦部細胞凋亡抑制功效評價

與正常對照組比較，模型組斑馬魚腦部細胞凋亡數(shù)明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚腦部細胞凋亡數(shù)明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低、中劑量組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚腦部細胞凋亡數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊高劑量組斑馬魚腦部細胞凋亡抑制功效為67%。見表4、圖3。

表4 參元丹膠囊對腦血栓斑馬魚腦部細胞凋亡抑制功效評價（n=20）

圖3 參元丹膠囊處理后腦血栓斑馬魚腦細胞凋亡表型圖（140x）

3 討論

腦血栓是由于患者的腦部血液供應障礙使腦組織局部出現(xiàn)不可逆的損傷，導致腦組織出現(xiàn)缺血和缺氧，最終導致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損[14-16]。氣虛血瘀是腦血栓急性期的主要病機[17-18]，中醫(yī)腦心同治理論認為，腦血栓和冠心病具有共同的中醫(yī)病機——氣虛血瘀[19-20]。參元丹膠囊由黃芪、水蛭、黨參、土元等中藥組成，臨床用于治療不穩(wěn)定型心絞痛，有效率可達90.3%[21]。方中黃芪和水蛭為君藥，配以黨參和土元，佐以地龍、丹參等共同起到益氣活血的功效。既往研究顯示，參元丹膠囊可明顯改善急性心肌梗死合并抑郁癥大鼠的行為異常，提高海馬神經(jīng)遞質(zhì)生成，促進海馬神經(jīng)損傷修復[22]。因此，基于腦心同治理論和參元丹膠囊既往實驗研究，推測參元丹膠囊有可能對腦血栓具有較好的治療作用。

傳統(tǒng)的哺乳動物腦血栓模型成本高、死亡率高、實驗周期長，從而限制其在藥理學中的應用。近年來，斑馬魚作為一種新的模式動物，因其成本低、可體外受精、可視性強、實驗周期短，而被廣泛用于評估藥物療效和安全性[23-25]。Zhu 等[13]報道，普納替尼處理后的斑馬魚，建立缺血性腦卒中模型，可出現(xiàn)斑馬魚腦血管內(nèi)皮損傷、腦血栓形成、血流量減少、運動能力下降，腦部細胞凋亡和炎癥反應加重現(xiàn)象。與腦血栓患者的臨床特征和病理較為相似，并且具有可視性強、實驗成功率高、周期短等優(yōu)勢，更適用于腦血栓治療藥物的快速療效評估和篩選實驗。因此，本研究采用普納替尼誘導的腦血栓斑馬魚模型評價參元丹膠囊對該病的治療作用，為與實驗體系保持一致，避免一些個體出現(xiàn)死亡，且有實驗顯示選取20 尾斑馬魚進行統(tǒng)計同30 尾結果無差異[26]，所以本研究將斑馬魚置于六孔板中，每組/每孔30 尾進行實驗，每組選取20 尾進行統(tǒng)計。本研究結果顯示，普納替尼處理18 h 后的斑馬魚腦部出現(xiàn)明顯的血栓表型，并伴隨運動能力變差、運動速度降低、血流變慢和明顯的腦部細胞凋亡。提示腦血栓斑馬魚模型是一個重復性好、操作簡便且造模死亡率低的實驗動物模型，值得推廣應用。

本研究結果顯示，參元丹膠囊可明顯降低斑馬魚腦血栓的發(fā)生率，還可明顯促進腦血栓斑馬魚的運動速度，改善其運動軌跡，此外，對腦血栓斑馬魚血流也有改善趨勢。在上述研究基礎上，本研究對其藥理機制進行初步探討，發(fā)現(xiàn)參元丹膠囊具有改善斑馬魚腦血栓的功效，可能與抑制斑馬魚腦部細胞凋亡有關。

綜上所述，參元丹膠囊對普納替尼誘發(fā)的腦血栓斑馬魚具有一定的改善作用，并且隨著濃度增加，其改善作用更明顯，與抑制斑馬魚腦部細胞凋亡有關。研究結果為拓展院內(nèi)制劑臨床應用新的適應證提供了實驗學依據(jù)，但其具體的藥理機制和具體干預環(huán)節(jié)還需深入研究。