常 燕 林建國 姚魁武

1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心血管科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京 100029

血脂異常，又稱高脂血癥，是指血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）和/或甘油三酯（triglyceride，TG）水平升高，包括低、高密度脂蛋白膽固醇血癥在內(nèi)的各種脂質(zhì)代謝紊亂。流行病學研究表明，TG 水平升高與動脈粥樣硬化和冠心病風險的增加密切相關，積極有效地預防和治療血脂異常可以明顯降低動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[1]。目前西藥降脂治療主要以他汀類藥物為主，雖能有效降低患者低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-choles terol，LDL-C）水平，但在治療過程中需監(jiān)測其安全性，避免藥物潛在的不良反應的發(fā)生[2]。中醫(yī)藥干預血脂異常具有多靶點、多途徑、多層次、副作用小、藥物依賴性低等特點，治療上具有明顯優(yōu)勢[3]。

越鞠丸出自朱丹溪的《丹溪心法》，由川芎、梔子、蒼術、香附、神曲組成，是治療郁證之名方，能解因痰、濕、熱、血、食所致諸郁。中醫(yī)將血脂異常歸于“痰濕”“痰瘀”“血濁”等范疇，認為痰、瘀、膏、濁均為水谷精微在病理情況下化生的郁滯產(chǎn)物，發(fā)病與中焦脾胃密切相關[4]?，F(xiàn)代藥理研究證實越鞠丸具有降低炎癥因子、提高心肌抗氧化能力、調(diào)節(jié)機體代謝等功能[5]，其中川芎有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗動脈粥樣硬化的作用[6]；梔子具有抑菌抗炎、抗氧化、降糖降脂等藥理活性[7]；蒼術具有調(diào)節(jié)胃腸的功能，通過抑制組織中前列素E2的生成，從而降低炎癥反應，對心血管有保護作用[8]；香附可降低血液中的血漿纖維蛋白原及血液黏度，從而糾正血脂紊亂，同時還具有降糖、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能等藥理作用[9]；神曲具有降血脂的功效。臨床研究證實，越鞠丸能夠顯著降低血清TC 水平，提高高密度脂蛋白膽固醇與TC 的比值，在調(diào)控血脂方面有明顯效果，但其具體作用機制尚不清楚[10]。故在此基礎上，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法預測越鞠丸的活性成分、作用靶點、信號通路，分析其治療血脂異常的作用機制。

1 資料與方法

1.1 越鞠丸的靶點收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類 藥 性（drug likeness，DL）≥0.18 進行條件篩選，檢索川芎、蒼術、梔子、香附的活性成分及對應靶點，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為相應基因名稱；神曲的活性成分根據(jù)已發(fā)表的文獻[11]收集獲取，在PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取活性成分化學結構，通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，最后整合得到越鞠丸活性成分及其作用靶點。

1.2 血脂異常靶點收集

通過GeneCards、DrugBank 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“hyperlipidemia” “hypercholesterolemia” “hypertriglyceridemia”為關鍵檢索詞進行查找，并對檢索得到的基因靶點進行處理，將上述3 個疾病數(shù)據(jù)庫的靶點整合，刪除重復值后獲得最終疾病靶點。

1.3 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡圖的繪制

獲取藥物活性成分作用靶點和疾病靶點的交集靶點，運用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制活性成分-交集靶點網(wǎng)絡圖，利用Network Analyzer 分析功能對網(wǎng)絡圖進行計算，根據(jù)結果篩選出核心活性成分。

1.4 核心蛋白的收集

通過STRING 平臺對交集靶點進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的繪制，將PPI 網(wǎng)絡信息導入Cytoscape 中，對蛋白網(wǎng)絡進行模塊化聚類處理，核心蛋白由CytoNCA 計算得出。

1.5 基因本體（GO）與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析

借助Metascape 平臺對交集靶點進行GO 和KEGG 富集分析，設定閾值P ＜0.01，并以富集的基因數(shù)目為篩選標準，選出目標數(shù)據(jù)，結果采用R 語言和Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行可視化。

1.6 分子對接

將“活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡圖中節(jié)點度值排名前5 的活性成分與PPI 網(wǎng)絡圖中節(jié)點度值排名前4 的核心蛋白進行分子對接，驗證其相互作用強度，活性成分結構通過PubChem 數(shù)據(jù)庫取得，蛋白質(zhì)結構由PDB 數(shù)據(jù)庫獲取。隨后利用Autodock Vina 1.1.2軟件實現(xiàn)分子對接，并將對接結果通過LigPlot 和Pymol 2.4.0 軟件優(yōu)化制圖。

2 結果

2.1 越鞠丸活性成分及其靶點獲取

通過TCMSP 平臺將篩選條件定為OB≥30%，DL≥0.18，檢索川芎、蒼術、梔子、香附的活性成分，通過已發(fā)表的文獻搜索神曲的活性成分，經(jīng)篩選收集到藥物活性成分56 個，其中川芎7 個、蒼術9 個、梔子15 個、香附18 個、神曲7 個，其中有6 個為共有活性成分，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對活性成分進行靶點預測，刪除重復項，共獲取376 個靶點基因。

2.2 血脂異常靶點獲取

通過GeneCards、DrugBank、OMIM 數(shù)據(jù)庫，分別收集到潛在靶點1153、58、129 個，合并靶點并刪除重復項后，共獲得潛在靶點1237 個。對疾病靶點與活性成分靶點取交集，共獲得113 個交集靶點。

2.3 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡圖分析

將113 個交集靶點借助Cytoscape 進行網(wǎng)絡圖繪制，見圖1。應用Network Analyzer 進行計算分析，得出159 個節(jié)點、611 條邊，平均度值為7.69。根據(jù)度值篩選出前5 名的活性成分為槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、漢黃芩素，見表1。推測上述化合物可能是越鞠丸治療血脂異常的主要活性成分。

圖1 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡圖

表1 度值前5 的活性成分

2.4 PPI 網(wǎng)絡分析

將113 個交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，從中獲取PPI 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，將其數(shù)據(jù)導入Cytoscape 中繪制網(wǎng)絡圖，使用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡節(jié)點進行分析，得到112 個節(jié)點、1415 條邊，平均度值為25.3，見圖2。圖中節(jié)點大小與顏色深淺代表其度值大小，度值越大，提示該節(jié)點蛋白與其他蛋白作用越廣泛。其中度值排名較高的有AKT1、IL6、VEGFA、TNF、EGF 等核心靶點。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖

2.5 GO 富集分析

借助Metascape 數(shù)據(jù)庫對113 個交集靶點進行基因富集分析，生物過程主要涉及細胞對脂質(zhì)、激素刺激、脂多糖的應答等過程，分子功能涉及細胞核受體活性、類固醇結合、磷酸酶結合等功能，細胞組分涉及膜筏、膜微域、膜區(qū)等成分。根據(jù)校正P 值排序，繪制3 個聚類分析前10 的條目。見圖3。

圖3 基因本體富集分析圖

2.6 KEGG 富集分析

KEGG 通路得到170 個條目，根據(jù)校正后P 值進行排序，將前20 條通路繪制成氣泡圖，見圖4。結果顯示與血脂異常密切相關的信號通路有AGERAGE、TNF、PPAR、insulin 等。通過整合以上數(shù)據(jù)，以大于平均度值（7.69）的活性成分為核心成分，以大于平均度值（25.3）的作用靶點為核心靶點，校對P 值前10 的生物過程條目和KEGG 為主要生物過程和信號通路，通過Cytoscape 軟件繪制成分-靶點-生物功能-通路網(wǎng)絡圖，見圖5。該圖展示了越鞠丸治療血脂異常的主要作用機制。

圖4 KEGG 富集氣泡圖

圖5 越鞠丸成分-靶點-生物功能-通路網(wǎng)絡圖

2.7 分子對接

利用Autodock Vina 軟件將活性成分-作用靶點網(wǎng)絡圖中節(jié)點度值排名前5 的活性成分和PPI 網(wǎng)絡圖中4 個關鍵核心蛋白進行分子對接，利用LigPlot和Pymol 軟件對結果進行輸出。一般來說配體和受體二者結合越穩(wěn)定，其結合能就越低。分子對接結果顯示，各活性成分與目標受體蛋白對接的結合能均＜-6 kJ/mol，說明活性成分能夠與配體自發(fā)結合，并借助氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構象，具體結果見表2。分子對接構像見圖6，其中豆甾醇與AKT1（-11.5 kJ/mol）結合性最好，對接最穩(wěn)定。

圖6 部分蛋白和活性成分分子對接圖

表2 核心活性化合物與核心蛋白結合能（kJ/mol）

3 討論

近年來，我國人群血脂異常發(fā)病率逐漸呈上升趨勢，其發(fā)生受肥胖、遺傳因素、飲食、年齡等各個因素影響?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)血脂異常發(fā)病機制主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、基因多態(tài)性、相關炎癥因子升高、氧化應激增強、腸道菌群失調(diào)相關[12]。臨床觀察性研究發(fā)現(xiàn)，越鞠丸在降低血清炎癥因子、抗動脈粥樣硬化、降脂固斑等方面療效顯著[13-14]。在小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型中，通過服用越鞠丸后，小鼠腸道菌群多樣性增多，其血清中TC 和LDL-C 含量明顯降低[15]。

本研究從網(wǎng)絡藥理學分析得出，越鞠丸治療血脂異常的藥物活性成分主要有槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、漢黃芩素。相關基礎研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過抑制內(nèi)皮細胞黏附和內(nèi)皮細胞NF-κB 信號通路減輕炎癥過程，降低動脈粥樣硬化大鼠的炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展；血漿槲皮素升高后，血清TC 和LDL-C 水平均有降低[16]；木樨草素可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子降低NPC1L1 的表達，通過調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白抑制膽固醇的轉(zhuǎn)運活性，從而降低血清中膽固醇含量[17]；豆甾醇通過部分阻斷膽固醇的吸收來降低LDL-C 的水平，同時防止INS-1 細胞中糖脂毒性誘導的游離膽固醇和活性氧水平的增加，具有抗動脈粥樣硬化作用[18]。分子對接提示，上述活性成分與主要核心靶點（AKT1、IL6、VEGFA、TNF）結合力較強，因此推測越鞠丸可能通過上述主要活性成分在降低炎癥反應、減少脂質(zhì)合成、促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和分布等方面發(fā)揮降脂作用。

通過PPI 網(wǎng)絡得到AKT1、IL6、VEGFA、TNF 等核心靶點，主要與細胞代謝、炎癥反應、基因表達、信號傳導等相關。其中AKT1 具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞（vessel smooth muscle cell，VSMC）的功能，增強VSMC 中AKT1 表達會延緩動脈粥樣硬化斑塊的進展[19]。VEGFA 作為調(diào)節(jié)脂肪組織血管生成的關鍵因素，通過調(diào)節(jié)脂肪組織VEGFA 的表達，對增強血管生成、減少炎癥反應和改善脂肪組織功能有著重要意義[20]。KEGG 富集分析得知，越鞠丸調(diào)治血脂異常主要通過AGE-RAGE、PPAR、insulin 等信號通路。AGE-RAGE 通過激活NF-κB 誘導炎癥反應，增強氧化應激。有學者認為AGE-RAGE 和NF-κB 兩者之間的相互作用與高脂血癥誘導的動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有關，實驗研究表明血清中sRAGE 水平與HDL 呈正相關，其含量升高可以減弱高脂血癥產(chǎn)生的氧化損傷[21-22]。PPAR 是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)基因表達以改變組織脂解和血漿脂蛋白代謝，通過激活PPAR 信號通路調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)代謝的PPARα 靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低肝細胞中TG 和TC 水平[23]。腦內(nèi)insulin 信號通過刺激肝臟TG 分泌而不引起高甘油三酯血癥，來保護肝臟免受異位脂肪堆積，并且可以改善如肥胖和糖尿病等情況下的肝脂肪變性[24]。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術初步預測越鞠丸中藥物主要活性成分與核心蛋白結合，通過調(diào)節(jié)炎癥因子、參與脂質(zhì)代謝和脂肪組織血管生成等方式，調(diào)控AGE-RAGE、PPAR、insulin 等內(nèi)分泌、炎癥信號通路，以降低氧化損傷，促進血脂代謝，改善肝臟功能，糾正機體脂質(zhì)代謝紊亂。然而，本研究僅從網(wǎng)絡藥理學和分子對接層面分析越鞠丸治療血脂異常的作用機制稍顯單薄，還需進一步完善和深入實驗研究的驗證，以期為今后的臨床應用和基礎研究提供相應的藥理依據(jù)。