周紫薇，項鄭昊，周化嵐，張建國

上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院 食品科學與工程研究所，上海 200093

畢赤酵母是一種典型的甲基營養(yǎng)型酵母,已成為較成功的外源蛋白表達系統(tǒng)之一[1]。至今已有5 000多種外源蛋白利用畢赤酵母成功表達[2]。目前畢赤酵母表達外源蛋白的過程優(yōu)化仍呈現(xiàn)多樣化的態(tài)勢，而且過程優(yōu)化的效果不夠明顯，其主要原因為采用液體培養(yǎng)的方式研究群體重組畢赤酵母的性能掩蓋了菌株之間的差異。而且，不同時間表征的指標來自于不同菌株。為了開展針對同一菌株的外源蛋白表達性能直接、有效地表征外源蛋白表達過程，研制一種無需分離純化產(chǎn)物、低成本的生化微反應器作為畢赤酵母的外源蛋白表達系統(tǒng)的組成部分具有實際應用意義。

微膠囊(Microcapsules)是應用天然或人工合成的高分子成膜壁材，將固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)的物質(zhì)作為芯材，包裹成具有半通透性或密封的球形微粒，粒徑尺寸一般為1 μm ～1000 μm。微膠囊可以隔絕外界不良環(huán)境(過高的pH、溫度、酶)保護芯材，也可以改善芯材性質(zhì)(屏蔽氣味、毒性、顏色)，控制芯材的釋放時間等作用。目前，微膠囊已廣泛應用于生物醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領域。微膠囊制備方法分為物理法、化學法和物理化學法三類。物理法通過物理、機械作用將壁材包覆在小分子芯材上，具體有空氣懸浮法[3]、溶劑揮發(fā)法[4]、噴霧干燥法[5]等?；瘜W法指化合物單體通過聚合反應形成聚合物外殼，再將芯材包覆，例如擠壓法、界面縮聚法[6]、原位聚合法等[7]。物理化學法通過添加溶劑(無機鹽、非電解質(zhì))或調(diào)節(jié)pH、改變溫度等措施調(diào)節(jié)聚合物溶解度，使聚合物從溶液中析出并沉積在芯材表面，形成微膠囊，例如相分離法[8,9]、層層組裝法[10]等。目前制備微膠囊的常用方法有噴霧干燥法、擠壓法、乳化法、層層組裝法等。其中乳化法通過海藻酸鈉與交聯(lián)劑進行凝膠化得到微膠囊，設備簡單，成本低。內(nèi)源乳化法制備微膠囊的過程中，難溶性鈣鹽的種類及濃度、乳化過程中水相和油相的體積比、表面活性劑的類型及濃度和油溶性酸的種類及濃度等因素都會影響海藻酸鈉微膠囊的包埋效果。對于畢赤酵母微膠囊化而言，碳酸鈣、檸檬酸鈣、草酸鈣、磷酸鈣和酒石酸鈣都是適用的鈣離子載體。其中，碳酸鈣是最常用的鈣離子載體，其形成的微膠囊成球性好、粒徑分布較窄、性質(zhì)穩(wěn)定[11]。例如，SONG等通過乳化法制備了酵母微膠囊，粒徑為35 μm～863 μm[12]。其中，海藻酸鈉微膠囊的粒徑是影響芯材性質(zhì)、微膠囊降解性、芯材與外界進行物質(zhì)交換，及釋放動力學的重要參數(shù)。微膠囊的最佳尺寸也根據(jù)不同芯材和應用場景的不同而變化。微膠囊粒度分布影響微膠囊體積、密度、流動性、復水性、溶解性和分散性等性質(zhì)，對芯材的負載、聚集和組織滯留有重要的影響。本研究選用分泌表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組畢赤酵母菌株GS115-gfp進行微膠囊的制備的條件優(yōu)化，為高效表達外源蛋白的重組畢赤酵母篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母(Komagataellaphaffii，原名Pichiapastoris)GS115-gfp來自本實驗室。

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養(yǎng)基：稱取1.0 g酵母粉、2.0 g蛋白胨、2.0 g葡萄糖(如配置固體培養(yǎng)基則再稱取2.0 g瓊脂粉)，加入100 mL去離子水混勻，在115℃條件下高壓滅菌15 min，室溫保存。

檸檬酸鈉溶液(0.06 mol/L)：稱取1.55 g檸檬酸鈉，加入70.0 mL去離子水，混合均勻，定容至100 mL，保存于室溫，備用。

G418遺傳霉素(100 mg/mL)：稱取1.0 g G418，加入7.0 mL去離子水，混合均勻，再定容至10 mL，過濾除菌，分裝保存于-20 ℃，備用。

碳酸鈣溶液：依據(jù)使用濃度稱取碳酸鈣，加入70.0 mL水混合均勻，再定容至100 mL，室溫保存。

1.2 方法

1.2.1菌懸液的制備

將冷凍保藏的畢赤酵母GS115-gfp在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)48 h培養(yǎng)后，挑取單菌落于5 mL 的YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，然后按4.0%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代2～3次，使菌種完全活化。

將活化好的畢赤酵母GS115-gfp按4.0%的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，20 h后，將處于對數(shù)期末期的菌懸液在4 ℃，6 000 r/min的條件下離心10 min，去上清液，菌體沉淀用無菌水洗滌兩次后，分散于10 mL無菌水中得到濃縮菌液。

1.2.2海藻酸鈉與畢赤酵母生物相容性的測定

配制海藻酸鈉質(zhì)量濃度分別為0%、1%和2%的YPD固體培養(yǎng)基，然后將畢赤酵母GS115-gfp菌液經(jīng)梯度稀釋后，點樣于YPD固體培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計菌落總數(shù)后計算活菌數(shù)。

1.2.3單因素優(yōu)化

將10 mL菌液與20 mL 0.375%海藻酸鈉、0.015%碳酸鈣混合均勻后，加入70 mL含有1% Span 80 的液體石蠟后攪拌20 min，最后加入 0.5 mL乙酸，攪拌30 min；加水洗滌后得到微膠囊。以液體石蠟為油相，分別考察了水油比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6和1∶1時對形成微膠囊的影響。乙酸添加量的優(yōu)化考察了鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶4時對形成微膠囊的影響。轉(zhuǎn)速優(yōu)化實驗考察了轉(zhuǎn)速為300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min和700 r/min時對形成微膠囊的影響。碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比分別考察碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1和4∶1時對形成微膠囊的影響。表面活性劑(Span 80)添加量的優(yōu)化考察了Span 80占油相體積0%、1.0%、1.5%和2.0%時對形成微膠囊的影響。

1.2.4響應面優(yōu)化

基于單因素實驗結(jié)果，以轉(zhuǎn)速(A)、Span80添加量(B)、水油比(C)為自變量，以微膠囊的粒徑和包埋率為響應值，采用Box-Behnken設計響應面分析對乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的制備條件進行優(yōu)化，通過響應面數(shù)據(jù)的處理分析確定其最佳的制備條件。響應面分析因素與水平設計見表1。

表1 響應面設計因素與水平表

1.3 分析方法

1.3.1畢赤酵母微膠囊粒徑分布的測定

將微膠囊置于載玻片上，用生物顯微鏡進行觀察并拍照，使用Image Pro Plus軟件測定微膠囊尺寸，并進行粒徑分布統(tǒng)計。

1.3.2包埋率的測定

稱取1.0 g微膠囊置于10 mL的0.06 mol/L檸檬酸鈉溶液中，30 ℃震蕩1 h，使海藻酸鈉微膠囊溶解并釋放包埋的畢赤酵母，采用稀釋平板法進行活菌計數(shù)。微膠囊的包埋率計算公式如下：

1.3.3畢赤酵母微膠囊的GFP誘導表達

分別設置了甲醇的添加量為0.5%、1.0%和1.5%，在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)畢赤酵母微膠囊。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉與畢赤酵母的生物相容性

海藻酸鈉與酵母菌的生物相容性決定著酵母菌在微膠囊內(nèi)的活性。圖1為不同海藻酸鈉添加量的YPD固體培養(yǎng)基上畢赤酵母GS115-gfp的生長情況。添加了1%和2%的海藻酸鈉的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)分別達到了7.3 lg CFU/mL和7.6 lg CFU/mL，分別為對照組的97.3%和101.3%，說明海藻酸鈉與畢赤酵母GS115-gfp生物相容性好(P>0.05)。

圖1 海藻酸鈉添加量對畢赤酵母GS115-gfp活細胞數(shù)的影響

2.2 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的單因素優(yōu)化

2.2.1水相和油相體積比(水油比)對微膠囊性質(zhì)的影響

當水油比小時，單位體積內(nèi)液體石蠟中分散的海藻酸鈉較少，在磁力攪拌的作用下，介質(zhì)中會產(chǎn)生較小的分散液滴，從而得到粒徑較小的海藻酸鈉微膠囊。由表2可以看出，隨著水油比的增大，微膠囊的平均粒徑逐漸增大，在水油比為1∶9時達到最大值，為(417±33)μm。水油比的改變對微膠囊的包埋率沒有顯著性的影響(P>0.05)。

表2 水油比對微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.2乙酸添加量對微膠囊性質(zhì)的影響

乙酸在乳化法制備微膠囊中起到至關重要的作用，當乙酸的添加量多時，碳酸鈣能夠釋放更多的鈣離子，使海藻酸鈉形成高強度的海藻酸鈉微膠囊，可以提高微膠囊的包埋率，降低微膠囊的粒徑，但是在體系中添加過量的乙酸會降低體系的pH，可能會造成體系內(nèi)酵母菌存活率的下降；當乙酸的添加量少時，碳酸鈣釋放的鈣離子減少，其通過油/水界面的擴散速率降低，碳酸鈣釋放的鈣離子減少，導致無法形成結(jié)構(gòu)致密的海藻酸鈉微膠囊。因此，本研究分別考察了鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶4時對微膠囊性質(zhì)的影響。

由表3可以看出，當鈣離子和乙酸的摩爾質(zhì)量比在的1∶2～1∶4的范圍內(nèi)時，微膠囊的粒徑在1∶3時達到最小值，為(359±65)μm，包埋率也達到最高值，為87.6%。

表3 乙酸添加量對微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.3轉(zhuǎn)速對微膠囊性質(zhì)的影響

轉(zhuǎn)速過小(實驗表現(xiàn)為小于300 r/min)時，形成的微膠囊聚集嚴重，成球性交叉，包埋率低，提高轉(zhuǎn)速，乳狀液中受到剪切應力增大，形成的微膠囊粒徑變小，但轉(zhuǎn)速過大(實驗表現(xiàn)為大于600 r/min)時，乳狀液中受到的剪切應力不均勻，形成的微膠囊較大。由表4可以看出，隨著磁力攪拌轉(zhuǎn)速的提高，微膠囊的粒徑逐漸減小。粒徑在轉(zhuǎn)速為600 r/min時達到最小，為(308±23)μm。在轉(zhuǎn)速為300 r/min～500 r/min的區(qū)間內(nèi)，包埋率在轉(zhuǎn)速為500 r/min時達到最大，為74.5%，在轉(zhuǎn)速為500 r/min～700 r/min的區(qū)間內(nèi)，包埋率隨著轉(zhuǎn)速的提高而下降。

表4 轉(zhuǎn)速對微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.4鈣離子與海藻酸鈉的摩爾質(zhì)量比(鈣膠比)對微膠囊性質(zhì)的影響

碳酸鈣含量的增加使得混合液中鈣離子的濃度增大，促使海藻酸鈉和鈣離子之間進行凝膠化反應，形成的微膠囊結(jié)構(gòu)更加致密，導致粒徑和減小，但鈣膠比超過一定程度，混合液中的海藻酸鈉濃度過低，使得形成的結(jié)構(gòu)變得松散，包裹的畢赤酵母容易流失，導致包埋率下降。由表5可知，隨著鈣膠比的增加，微膠囊的粒徑有下降的趨勢，當鈣膠比為3∶1時微膠囊的粒徑平均粒徑最小為(309±49)μm；微膠囊的包埋率在1∶3時最高，為90.5%。

表5 鈣膠比對微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.5表面活性劑添加量對微膠囊性質(zhì)的影響

在表面活性劑的添加量較低時，不能很好的覆蓋分散相表面，微膠囊的穩(wěn)定性低，聚集生成較大的微膠囊，而在表面活性劑的添加量足夠高時，表面活性劑降低了水相和油相之間的表面張力，同時高濃度的Span 80使油/水界面上Span 80分子排列更加緊密，降低了通過油/水界面擴散到海藻酸鈉溶液中乙酸的量和速度，從而得到粒徑較小的微膠囊。但當表面活性劑的添加量過多(Span 80的濃度大于臨界膠束濃度(CMC)，實驗表現(xiàn)為Span 80濃度超過1.5%)時，混合液中Span 80的親水基團與海藻酸鈉分子相互吸引，使得原本自由伸展的海藻酸鈉長鏈分子向膠束中心彎曲，溶液收縮應力增大，表面張力增大，微膠囊的粒徑也隨之增大。由表6可以看出，隨著Span 80添加量的增加，微膠囊的粒徑逐漸減小，當Span 80添加量為1.5%時粒徑最小，為168±18 μm。微膠囊的包埋率在0.5%～1.0%的區(qū)間內(nèi)隨著Span 80添加量的增多而提高，隨后包埋率隨Span 80添加量的提高而降低，當Span 80添加量為1.0%時包埋率最高，為86.5%。

表6 Span 80的添加量對微膠囊性質(zhì)的影響

2.3 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的響應面優(yōu)化

以乳化過程中磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速(A)、表面活性劑Span 80添加量(B)、水油比(C)為自變量，微膠囊的粒徑和包埋率為響應值，進行三因素三水平實驗優(yōu)化，共17組試驗方案。響應面設計及結(jié)果見表7。

表7 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的響應面方案及結(jié)果

利用Design-Expert軟件對表7的數(shù)據(jù)進行響應面分析，擬合得到微膠囊的粒徑和包埋率關于A、B、C的三元二次多項回歸方程：

Y=82.28+3.51A+0.783 4B+0.279 6C+5.45AB+3.85AC+0.987 2BC+39.28A2+6.21B2+27.28C2

(1)

Y=79.02-0.387 5A-1.15B-2.55C+0AB-4.13AC-3.62BC-4.44A2-2.24B2-3.76C2

(2)

式(1)和式(2)分別為粒徑和包埋率的回歸方程。

對回歸模型進行方差分析與顯著性檢驗。模型的P值均小于0.05，表明模型差異顯著；失擬項均大于0.05，說明模型具有較好的擬合度，表面模型能較準確的反映了轉(zhuǎn)速、Span 80添加量、水油比對微膠囊粒徑和包埋率的影響。因此可以用回歸模型對實際的實驗結(jié)果進行分析和預測。

回歸方程中各項系數(shù)絕對值的大小能直接反映各因素對響應值的影響程度，其正負表示影響的方向。由式(1)和式(2)的各項系數(shù)可知，各因素影響微膠囊粒徑的顯著性大小為：水油比>Span 80添加量>轉(zhuǎn)速；各因素影響微膠囊包埋率的顯著性大小為：轉(zhuǎn)速>Span 80添加量>水油比。采用Design-Expert軟件優(yōu)化回歸方程模型，最佳制備條件為：轉(zhuǎn)速為529.09 r/min、Span 80添加量為1.48%和水油比為0.41。得到的微膠囊最小粒徑為88.02 μm，包埋率為79.53%。

圖2為乳化法制備微膠囊中轉(zhuǎn)速、Span 80添加量和水油比三者之間交互作用對微膠囊粒徑的響應面圖。由圖2(a、b)可知，水油比為0.466 5，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的粒徑隨著Span 80添加量的增大呈緩慢下降趨勢；固定Span 80添加量時，微膠囊的粒徑隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先下降后上升趨勢，微膠囊粒徑的最小值在轉(zhuǎn)速為500 r/min ～600 r/min和Span 80添加量為1.0%～1.5%的范圍內(nèi)，且存在最低點，即為圖2(b)等高線中的點5。由圖2(c、d)可知，Span 80添加量為1.5%，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的粒徑隨著水油比的增大呈先下降后上升趨勢；水油比固定，微膠囊的粒徑隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先下降后上升趨勢，微膠囊粒徑的最小值在轉(zhuǎn)速為500 r/min ～600 r/min和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最低點，即為圖2(d)等高線中的點5。由圖2(e、f)可知，轉(zhuǎn)速為500 r/min，Span 80添加量固定時，微膠囊的粒徑隨著水油比的增大呈先下降后上升趨勢；水油比固定時，微膠囊的粒徑隨著Span 80添加量的增大呈緩慢下降后緩慢上升趨勢，微膠囊粒徑的最小值在Span 80添加量為1%～2%和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最低點，即為圖2(f)等高線中的點5。

圖3為乳化法制備微膠囊中轉(zhuǎn)速、Span 80添加量、水油比三者之間交互作用對微膠囊包埋率的響應面圖。由圖3(a、b)可知，水油比為0.466 5，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的包埋率隨著Span 80添加量的增大呈先上升后下降趨勢；固定Span 80添加量時，微膠囊的包埋率隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先上升后下降趨勢，微膠囊包埋率的最大值在Span 80添加量為1%～2%和轉(zhuǎn)速為400 r/min ～600 r/min的范圍內(nèi)，且存在最高點，即為圖3(b)等高線中的點5。由圖3(c、d)可知，Span 80添加量為1.5%，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的包埋率隨著水油比的增大呈下降趨勢；水油比固定，微膠囊的包埋率隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先上升后下降趨勢，微膠囊包埋率的最大值在水油比為0.439 8～0.493 2和轉(zhuǎn)速為400 r/min ～600 r/min的范圍內(nèi)，且存在最高點，即為圖3(d)等高線中的點5。由圖3(e、f)可知，轉(zhuǎn)速為500 r/min，Span 80添加量固定時，微膠囊的包埋率隨著水油比的增大呈下降趨勢；水油比固定時，微膠囊的包埋率隨著Span 80添加量的增大呈上升趨勢，微膠囊包埋率的最大值在Span 80添加量為1%～2%和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最高點，即為圖3(f)等高線中的點5。

結(jié)合實際條件，將最佳制備參數(shù)調(diào)整為轉(zhuǎn)速500 r/min、水油比0.466 5和Span 80添加量為1.5%，制備所得微膠囊的粒徑為93.032 μm，包埋率為80.1%，實際值與理論值接近。因此，證實該模型能較好地模擬并預測微膠囊的粒徑和包埋率。

(a)

(a)

2.4 畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的形態(tài)觀察及其GFP誘導表達

乳化法制備所得的海藻酸鈉畢赤酵母微膠囊，呈規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，微膠囊之間存在相互粘連的現(xiàn)象，在內(nèi)部清晰可見畢赤酵母的聚集存在(圖4a)。經(jīng)過0.5%、1.0%和1.5%甲醇添加量的24 h誘導后，微膠囊內(nèi)的畢赤酵母GS115-gfp均在微膠囊內(nèi)表達了綠色熒光蛋白。其中，在甲醇添加量為1.0%時的微膠囊綠色熒光最為顯著，此時誘導作用最好(圖4b、c、d)。

(a)畢赤酵母微膠囊

3 結(jié)果

本研究對畢赤酵母GS115-gfp以海藻酸鈉為壁材，通過乳化法制備了微膠囊并對其進行了優(yōu)化，降低了微膠囊的粒徑，提高了微膠囊的包埋率，同時以甲醇為誘導劑，對GFP進行了誘導表達。海藻酸鈉與畢赤酵母的生物相容性良好，可以作為畢赤酵母微膠囊的壁材。使用乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊并對其制備條件進行單因素及響應面優(yōu)化的實驗結(jié)果表明，最佳制備參數(shù)為轉(zhuǎn)速500 r/min、水油比0.466 5、Span 80添加量為1.5%，鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶3，鈣離子與海藻酸鈉的摩爾質(zhì)量比為1∶3，制備所得微膠囊的粒徑為(93.032±11)μm，粒徑分布區(qū)間為85 μm ～105 μm，包埋率為80.1%。乳化法制備畢赤酵母微膠囊的GFP誘導表達結(jié)果表明，在不同濃度甲醇的誘導下，畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊均表達了綠色熒光蛋白GFP，這表示該微膠囊具有比較好的物質(zhì)通透性，可以將甲醇輸送給內(nèi)部的畢赤酵母對其進行誘導表達，這為單細胞蛋白的測量提供了一種可行的方法，對后續(xù)研究單細胞的個體差異，了解細胞個體對于樣品異質(zhì)性的精確貢獻，促進對細胞表達過程的理解有重要意義。