何妍之

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

抗菌肽是一種廣譜抗菌的多肽類物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，耐藥性較低，已成為動(dòng)物飼料中常用的添加劑。目前，抗菌肽已逐漸在動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用。王曉楠等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加抗菌肽能促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，顯著提高肉雞免疫功能。孫笑非等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽作為豬飼料添加劑，能有效維持豬腸道菌群的平衡，促進(jìn)腸道對(duì)飼料的消化與吸收，提高豬的生長(zhǎng)速率，改善機(jī)體免疫功效。史慶超等（2014）發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加抗菌肽能顯著提高吉富羅非魚(yú)的生長(zhǎng)速率和免疫功能。黃小紅等（2018）發(fā)現(xiàn)，添加抗菌肽能促進(jìn)草魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育，顯著提高草魚(yú)的免疫功能?？咕氖且环N綠色飼料添加劑，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、分子量小、抗菌效果好等特點(diǎn)。

抗菌肽是一類小分子物質(zhì)，來(lái)源于生物體內(nèi)的水解物，在正常情況下，大多數(shù)抗菌肽帶正電荷。飼料中抗菌肽的分離純化作用機(jī)制是帶正電荷的抗菌肽和帶負(fù)電荷的離子交換劑結(jié)合在一起，抗菌肽與固定相結(jié)合，經(jīng)高離子緩沖液對(duì)抗菌肽進(jìn)行洗脫，將抗菌肽從離子交換劑洗脫到緩沖液中，從而分離出抗菌肽。針對(duì)飼料原料內(nèi)各組成分的測(cè)定，高效液相色譜技術(shù)具有檢測(cè)速度快、靈敏度強(qiáng)、安全和精確度強(qiáng)等特性。高效液相色譜技術(shù)在高分子蛋白的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)較為明顯，能更好地精準(zhǔn)確定高分子蛋白等的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)。因此，高效液相色譜技術(shù)在飼料蛋白分子測(cè)定中廣泛應(yīng)用。本文對(duì)飼料添加劑中的抗菌肽采用高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，并測(cè)定飼料添加劑抗菌肽的含量，為飼料產(chǎn)品中抗菌肽的含量提供合適的檢測(cè)方法，為飼料中抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料 飼料、抗菌肽樣品。

1.2 試劑和溶液 甲醇、磷酸（分析純）、純凈水（分析純）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：稱量5 g標(biāo)準(zhǔn)抗菌肽制品，將其放入100 mL錐形瓶中，配制抗菌肽樣品濃度為3 mol/L的儲(chǔ)備液，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋10倍，配制流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為 0.25、0.5、0.75、1和1.5mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

對(duì)照溶液：取5 g飼料樣品放入天平中，精準(zhǔn)稱量飼料樣品質(zhì)量，將其放入250 mL錐形瓶中，加入適量無(wú)水乙醇，超聲波加速溶解，冷卻，加入無(wú)水乙醇稀釋到容量瓶刻度線，搖勻，作為對(duì)照組樣品。對(duì)照組樣品溶液進(jìn)行搖勻、過(guò)濾和冷置，制備陰性對(duì)照組樣品。

1.4 固相萃取柱 本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取柱洗脫和分離飼料樣品，固相萃取柱用4 mL甲醇和堿性溶液活化，用飼料提取液初步潤(rùn)洗固相萃取柱，飼料提取液流速設(shè)置為2 mL/min，再用滅菌水和甲醇洗脫，收集固相萃取洗脫液體。洗脫液放入濾膜過(guò)濾后進(jìn)行混合，而后使用高效液相色譜儀檢測(cè)洗脫液。

1.5 液相色譜儀條件 本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜柱為C18柱，固定流動(dòng)相為甲醇-純凈水（體積比為9∶1），固定流動(dòng)相的流速控制為2 mL/min，保持色譜柱溫度為32℃，高效液相色譜儀的檢測(cè)樣品量為10 uL，儀器的檢測(cè)波長(zhǎng)控制在550～850 nm，多次反復(fù)測(cè)量液相色譜圖。

1.6 飼料抗菌肽分離純化的線性關(guān)系測(cè)定 將5 g標(biāo)準(zhǔn)抗菌肽樣品放入250 mL錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇，采用高溫加熱加速標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解，制定標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其作為對(duì)照組。用3 mol/L抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配置濃度為 0.25、0.5、0.75、1 和 1.5mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各標(biāo)準(zhǔn)溶液組用移液槍量取10 μL放入高效液相色譜儀中，測(cè)定各組的峰面積，以各組峰面積為縱坐標(biāo)，各組樣品濃度為橫坐標(biāo)建立線性方程，測(cè)定其含量變化。

1.7 樣品回收率實(shí)驗(yàn) 將適量樣品放入500 mL回收瓶中，分別加入對(duì)照組液體5 mL，依照對(duì)照組液體配置回收樣品，對(duì)樣品濃度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算樣品回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中抗菌肽的分離純化條件優(yōu)化 抗菌肽易溶于水和醇類，本實(shí)驗(yàn)對(duì)飼料中抗菌肽采用初步提取法，有效提高抗菌肽的純度，再用高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，高效液相色譜儀的流動(dòng)固定相為甲醇，甲醇與水的體積比為9∶1，雜質(zhì)與抗菌肽的分離效果好。

2.2 飼料中抗菌肽的液相色譜條件的優(yōu)化 建立液態(tài)流動(dòng)相，采用紫外檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相抗菌肽溶液掃描檢測(cè)，定量結(jié)果由圖1所示，紫外檢測(cè)飼料中抗菌肽溶液的波長(zhǎng)最大值為526 nm，吸光度最大。因此，飼料中抗菌肽溶液的檢測(cè)波長(zhǎng)為526 nm，結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)雜質(zhì)干擾。

圖1 抗菌肽紫外檢測(cè)圖

飼料中抗菌肽用C18柱進(jìn)行色譜分離，使飼料抗菌肽與其他雜質(zhì)分離，結(jié)果準(zhǔn)確度高，且純度更高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗菌肽的液相色譜條件進(jìn)行分析和優(yōu)化，包括色譜柱溫度、流動(dòng)相體積比、流動(dòng)相速率及樣品停留時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜中提高流動(dòng)相速率，流動(dòng)相甲醇體積比及液體流動(dòng)時(shí)間都對(duì)色譜圖中峰的寬度有影響；實(shí)驗(yàn)將流速設(shè)置為0.75 mL/min，甲醇體積比為10%，柱溫度為31℃。流動(dòng)相中加入一定量的酸性溶液會(huì)有效改變色譜圖的峰值，且磷酸-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，該峰線平穩(wěn)，峰值穩(wěn)定。為了維持液相色譜儀中色譜柱的安全有效性，流動(dòng)相加入磷酸的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲酸和乙酸。由圖2高效色譜圖結(jié)果可知，該條件下抗菌肽的停留時(shí)間為7.56 min，且保持良好的峰值狀態(tài)。

圖2 抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色圖譜

2.3 飼料中抗菌肽分離純化的結(jié)果分析 飼料中抗菌肽液體經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀分離純化后，經(jīng)過(guò)固相萃取后所得上清液，再經(jīng)膜過(guò)濾后得到4個(gè)組分，結(jié)果如表1。由表1可知，抗菌肽的上清液經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾后被分離層析為各組成分，上清液中抗菌肽的含量最高，低于5 ku的抗菌肽濃度最小，總抗菌肽含量最低，5-10 ku的抗菌肽分子的活性最高，低于5 ku的抗菌肽活性為0。

表1 飼料中抗菌肽分離純化的結(jié)果

2.4 飼料中抗菌肽的固相萃取柱的處理方法分析 抗菌肽上清液進(jìn)行過(guò)膜過(guò)濾后，上高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，操作較為便捷。本研究中采用固相萃取柱對(duì)抗菌肽上清液進(jìn)行凈化與濃縮，用甲醇和氫氧化鈉進(jìn)行活化，抗菌肽的離子化程度加強(qiáng)，更易保留在萃取柱中。該抗菌肽的上清液更好過(guò)固相萃取柱，用甲醇淋洗，將液體洗脫完畢后，抗菌肽的上清液流入洗脫液中。由圖3所示，飼料中抗菌肽上清液經(jīng)過(guò)固相萃取柱濃縮后，其色譜峰值的基線更低，抗菌肽濃度更高，以達(dá)到凈化目的。

推薦理由:本書(shū)試圖構(gòu)建一個(gè)分析思考的理論框架，以兼收并蓄的融合視角探討新時(shí)代下“中華傳統(tǒng)的道德與和諧、西方文明的科學(xué)與理性、社會(huì)主義的理想與奉獻(xiàn)”三源合流的可能性及邏輯基礎(chǔ)。作者從文化理念的深層角度，對(duì)當(dāng)下如何走出迷茫，依靠何種“定力”實(shí)現(xiàn)民族的偉大復(fù)興進(jìn)行了探究。

圖3 固相萃取柱飼料中抗菌肽的高效液相色譜圖

2.5 飼料中抗菌肽含量的線性關(guān)系分析 以抗菌肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參照對(duì)象，依據(jù)優(yōu)化的抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)色譜條件進(jìn)行飼料抗菌肽的含量定量分析。以標(biāo)準(zhǔn)抗菌肽溶液為縱坐標(biāo)，色譜峰的面積值為橫坐標(biāo)建立線性標(biāo)準(zhǔn)方程。

該標(biāo)準(zhǔn)方程圖如4所示：

由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=aX+b，a=554.25，b=321622，R2=0.9644，結(jié)果表明，飼料中抗菌肽樣品濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)是0.964。

圖4 飼料中抗菌肽含量的線性關(guān)系

抗菌肽溶液按照相關(guān)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，液相色譜儀測(cè)定進(jìn)樣抗菌肽濃度為0.5 mol/L，確定其本實(shí)驗(yàn)抗菌肽的測(cè)定量為3mg/kg。

2.6 液相色譜的穩(wěn)定性分析 采用液相色譜分析法對(duì)動(dòng)物飼料添加劑、水產(chǎn)動(dòng)物飼料和家禽飼動(dòng)物料抗菌肽含量進(jìn)行測(cè)定，按照上述要求進(jìn)行處理，在高效液相色譜儀中連續(xù)進(jìn)樣10次，測(cè)定不同類型飼料樣品的起峰時(shí)間和峰值大小，并計(jì)算其相對(duì)偏差。結(jié)果表明：動(dòng)物飼料添加劑，水產(chǎn)動(dòng)物飼料和家禽動(dòng)物飼料中抗菌肽色譜圖中，不同樣品的起峰時(shí)間和峰值大小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.5%，平均值較為穩(wěn)定，結(jié)果證實(shí)該高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定。

2.7 液相色譜的精密度和準(zhǔn)確性分析 參照前面的飼料抗菌肽添加水平，對(duì)不同類型的飼料添加不同含量的抗菌肽，每組測(cè)定10個(gè)重復(fù)。由表3可知，動(dòng)物飼料添加劑、水產(chǎn)動(dòng)物飼料和家禽飼動(dòng)物料的抗菌肽回收率分別為96.4%、98.4%和99.7%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%，結(jié)果表明，液相色譜儀測(cè)定數(shù)據(jù)的精密度和準(zhǔn)確性良好。

表2 液相色譜的穩(wěn)定性分析

表3 液相色譜的精密度和準(zhǔn)確性分析

2.8 飼料中抗菌肽的含量測(cè)定 本研究采用液相色譜儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)不同類型飼料中抗菌肽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液體動(dòng)物飼料添加劑的抗菌肽測(cè)定值為2.45 mg/kg，水產(chǎn)動(dòng)物飼料和家禽動(dòng)物飼料的抗菌肽測(cè)定值分別是3.14和2.56 mg/kg。圖譜（圖5-6）結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)樣品中抗菌肽沒(méi)有雜質(zhì)干擾，只有抗菌肽一個(gè)峰，飼料中抗菌肽樣品峰值與標(biāo)準(zhǔn)峰值完全重合，說(shuō)明色譜的前期處理和液相色譜條件較好。

表4 飼料中抗菌肽的含量測(cè)定

圖5 抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖6 待測(cè)飼料中抗菌肽樣品中色譜峰圖

3 討論

3.1 高效液相色譜測(cè)定方法的優(yōu)勢(shì)分析 抗菌肽作為一種綠色飼料添加劑，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防護(hù)中起到重要作用。從飼料添加劑中分離純化抗菌肽具有廣闊的發(fā)展空間。根據(jù)抗菌肽的物理特性，凝膠過(guò)濾分析和離子交換層析被應(yīng)用于抗菌肽的初步過(guò)濾，將初步處理的抗菌肽液體放入高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化。樊陳等（2013）對(duì)地衣芽孢桿菌的抗菌肽分離純化進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初步發(fā)酵地衣芽孢桿菌，發(fā)酵液被離心機(jī)分離后，經(jīng)超濾濃度和離子交換層析等步驟，濃縮液被分子篩凝膠過(guò)濾和層析后，將濃縮液體放入液相色譜儀中獲得分離純化的抗菌肽。本實(shí)驗(yàn)中地衣芽孢桿菌的抗菌肽分離純化分4步，但其濃縮液進(jìn)行2次層析，將會(huì)增加樣品分離純化的成本，操作過(guò)程繁瑣。陳雪麗等（2007）對(duì)芽孢桿菌的菌體蛋白分離純化過(guò)程進(jìn)行深入研究，本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨分級(jí)沉淀和固體液相柱層析獲得菌體蛋白，該方法提取的蛋白含量較低，損耗較大。于佳民等（2021）采用超濾濃縮對(duì)芽孢桿菌中抗菌肽進(jìn)行初步分離，且損耗較少，分離速率快，便于操作，凝膠層析采用層析柱來(lái)分離不同大小的蛋白，分離范圍較為精準(zhǔn)，符合抗菌肽的分離條件。本研究對(duì)飼料中抗菌肽樣品進(jìn)行研磨，用超濾過(guò)濾方法進(jìn)行初步分離，再用固相萃取柱對(duì)飼料樣品溶液進(jìn)行濃縮，濃縮液均采用濾膜過(guò)濾后，最后濃縮液放入高效液相色譜儀即可獲得飼料中分離純化的抗菌肽，該方法操作簡(jiǎn)單，且分離速率快，靈敏度高，方法準(zhǔn)確。

本研究表明，抗菌肽在甲醇、磷酸中均可溶解，此次選用甲醇作為液態(tài)流動(dòng)相，且溶解效率高。因此，本研究用甲醇作為溶劑，溶解效率高，便于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。采用高效液相色譜儀分離純化飼料中的抗菌肽，對(duì)抗菌肽的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的流速、比例及固相萃取柱溫度都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)飼料中抗菌肽的分離純化高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，精準(zhǔn)測(cè)定飼料中抗菌肽的含量，為飼料中抗菌肽添加量提供參考依據(jù)。

3.2 采用高效液相色譜測(cè)定方法對(duì)不同類型飼料抗菌肽含量精確分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同類型飼料抗菌肽添加量結(jié)果的穩(wěn)定性和精密度進(jìn)行分析、比較，采用高效液相色譜儀測(cè)定不同類型飼料樣品抗菌肽的起峰時(shí)間和峰值大小，分析不同類型樣品的相對(duì)偏差，結(jié)果表明，不同類型飼料抗菌肽的起峰時(shí)間和峰值面積相對(duì)偏差較小，測(cè)定抗菌肽的結(jié)果穩(wěn)定性強(qiáng)，精密度高，準(zhǔn)確度強(qiáng)。張二鵬等（2021）利用高效液相色譜法測(cè)定保健食品中鞣花酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，與本研究結(jié)果類似。

本研究采用高效液相色譜分析法對(duì)不同類型飼料中抗菌肽進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)樣品中抗菌肽峰值與飼料待測(cè)樣品的抗菌肽峰值相似，表明結(jié)果的精密度高，準(zhǔn)確度強(qiáng)，且能有效測(cè)定飼料中不同類型的蛋白大分子含量，也為飼料樣品含量的測(cè)定研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究最佳的飼料抗菌肽分離純化方法是高效液相色譜法，發(fā)酵液采用超濾層析和固相萃取法對(duì)其進(jìn)行濃縮和層析，樣品溶液經(jīng)過(guò)濾后放入高效液相色譜儀獲得分離純化的抗菌肽，在此基礎(chǔ)上，抗菌肽的保留時(shí)間為7.25 min，當(dāng)濃度為500～3800g/L時(shí)，飼料中抗菌肽的峰面積與抗菌肽樣品濃度呈線性關(guān)系，且準(zhǔn)確度高，精密度強(qiáng)。該方法具有操作方便、檢測(cè)速率快、靈敏度高和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。