孟 爽，周 立，付 勤，夏 立，孟麗媛

上海交通大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學公共技術平臺，上海 200025

環(huán)孢菌素A （cyclosporine A，CsA）、他克莫司（tacrolimus，TaC）、西羅莫司（sirolimus，SiR）、依維莫司（everolimus，EvE）是4 種常用的免疫抑制劑，已被成功應用于臨床上肝、腎、肺等多種器官的移植［1-3］。然而，作為窄治療指數(shù)（narrow therapeutic index，NTI）藥物，其治療劑量與毒性劑量間的差別很?。?-6］，因此免疫抑制劑的合理用藥需在臨床藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）的指導下進行，以提高患者用藥的有效性和安全性［7-8］。此外，不同免疫抑制劑聯(lián)合使用時，會產(chǎn)生協(xié)同效應，在臨床實踐中通常將它們合并使用以減少毒性和不良反應［1，9］。除器官移植外，CsA 可負載到重組脂蛋白上用于治療顱腦損傷［10］，EvE 可裝載至H-鐵蛋白納米籠上用于治療乳腺癌［11］等。因此，開發(fā)出可應用于臨床檢測，且能夠同時分析多種免疫抑制劑的定量檢測方法至關重要。目前，免疫抑制劑藥物的臨床監(jiān)測主要基于2 種方法——免疫熒光或比色檢測以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）法［12-13］。同LC-MS/MS 法相比，盡管免疫分析方法快速且價格便宜，然而卻存在高交叉反應性的干擾，使得檢測方法的特異性低，從而可能導致定量結果的高估［14-15］。已有很多報道闡述了LC-MS/MS 在免疫抑制劑定量檢測分析中的突出優(yōu)勢［16-19］。如Mei 等［16］使用LCMS/MS 法同時檢測了CsA 和TaC，其最低定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為5.0 ng/mL 和0.2 ng/mL，并評估了化學發(fā)光微粒免疫法（chemiluminescence microparticle immunoassay，CMIA） 與LC-MS/MS 法的差異；Krná? 等［17］與Gong 等［18］開發(fā)了能夠同時檢測4 種常用免疫抑制劑的LC-MS/MS 方法（CsA 的LOQ 為5.0 ng/mL，SiR、TaC 和EvE 的LOQ 為0.5 ng/mL）。盡管上述報道能夠滿足免疫抑制劑應用于臨床器官移植TDM 的一般需求，然而仍然需要開發(fā)更高靈敏度的方法以實現(xiàn)這4 種免疫抑制劑更廣泛的臨床應用。

在LC-MS/MS 定量分析中，為了獲得更高的檢測靈敏度及準確度，通常需要對色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。其中，流動相及流動相添加劑，如常用的甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、乙酸、甲酸銨（ammonium formate，AF）、乙酸銨（ammonium acetate，AA）、氫氧化銨等的選擇能夠影響色譜峰分離度、峰形，并通過影響離子源中離子的形成從而影響檢測靈敏度［20-22］，因此是影響定性及定量檢測的關鍵。電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）是連接液相色譜和質(zhì)譜最廣泛使用的電離源，通過調(diào)整ESI 源參數(shù)設置，例如氣、溫度、電壓等，能夠影響化合物的電離效率及離子化碎片從而影響定性和定量結果［23-25］。盡管已有研究開始致力于更高靈敏度的方法開發(fā)（例如Bittersohl 等［26］使用LC-MS/MS 方法同時測定了腎移植患者中游離的CsA 和霉酚酸，其CsA 的檢測靈敏度明顯提升，LOQ 為0.1 ng/mL 等），至今還沒有研究通過系統(tǒng)評價并優(yōu)化色譜質(zhì)譜參數(shù)，從而開發(fā)能夠簡易有效地提高檢測靈敏度的方法。

本研究考察色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)對免疫抑制劑定量結果的影響，包括流動相的選擇、流動相改性劑的添加及離子源參數(shù)的設置（包括氣、電壓、溫度等）。本研究旨在通過評估色譜條件及質(zhì)譜離子源參數(shù)對LC-MS/MS分析中分析物的電離和碎片化的影響，探索一種能夠簡便地提高定量靈敏度的思路，助力LC-MS/MS 方法開發(fā)和優(yōu)化的有效進行。

1 材料與方法

1.1 試劑

本實驗所用的試劑均為商業(yè)化產(chǎn)品而非經(jīng)自行純化。色譜純乙腈購自德國Honeywell公司，色譜純甲醇購自美國Merck 公司，超純水由RephiLe 純水儀制備。質(zhì)譜純的FA 購自美國ThermoFisher Scientific 公司，色譜純的AF購自美國ALDRICH 公司，色譜純的AA 購自美國Fluka公司。CsA、TaC 及SiR 標準品購自加拿大的TRC 公司，EvE標準品購自加拿大TLC公司。

1.2 儀器及軟件

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）系統(tǒng)為島津的LC-30A 系列，配有LC-30AD二元泵，SIL-30AC自動進樣器以及CTO-30A柱溫箱。質(zhì)譜系統(tǒng)為SCIEX 公司的QTRAP 6500 plus 系列，配有IonDrive Turbo V 離子源以及IonDrive 高能檢測器等。所有質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)的處理采用質(zhì)譜儀自帶的Analyst 軟件（V1.7.0）以及定量軟件MultiQuant（V3.0）進行分析。

1.3 方法

1.3.1 色譜及質(zhì)譜方法的建立 采用多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式定量分析免疫抑制劑。首先，通過針泵推注直接進樣法確定4種免疫抑制劑的母離子（precursor ion，Q1）和子離子（product ion，Q3）定量離子對（Q1/Q3）。具體方法為：使用甲醇分別配制CsA、TaC、SiR 及EvE 的標準品儲備液1 mg/mL，再用甲醇分別稀釋至5 μg/mL，經(jīng)針泵推注至質(zhì)譜儀。通過采集一級、二級質(zhì)譜信息，最終確定各自的定量離子對及相應的碰撞能量等參數(shù)。色譜柱選用Waters公司的ACQUITY UPLC?BEH C18 （2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）， 保護柱為 ACQUITY UPLC?BEH C18 VanGuardTMPre-Column （2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）。流動相：A 為有機相，選擇甲醇或乙腈；B 為水相。為了改善色譜峰峰形、提高信號強度，流動相均添加0.1%FA。洗脫梯度為：0～2 min，40% B；2～6 min，40% B→0 B；6～8 min，0 B；8～8.01 min，0 B→40% B；8.01～10 min，40% B。流速為0.5 mL/min，色譜柱溫度設置為50 ℃，自動進樣器溫度設置為4 ℃。

1.3.2 流動相對其響應的影響 為了考察流動相對4種免疫抑制劑定量結果的影響，采用甲醇或乙腈作為有機相，并且使用含不同濃度緩沖鹽（AF 或AA，濃度為5、10或20 mmol/L）的水相體系，考察AF或AA 的添加對定量分析的影響。考察流動相的影響時，質(zhì)譜條件選擇匹配0.5 mL/min的流速下常用的離子源參數(shù)設置：離子源電壓（ionSpray voltage，IS） 為5 500 V，離子源溫度（ion source temperature，TEM）為550 ℃，噴霧氣（ion source gas 1，Gas 1）為50 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氣（ion source gas 2，Gas 2） 為50 psi，氣簾氣（curtain gas，CUR）為35 psi，碰撞氣（collision gas，CAD）為低流速。

1.3.3 質(zhì)譜參數(shù)對其響應的影響 為了考察質(zhì)譜離子源參數(shù)對4 種免疫抑制劑定量結果的影響，設置IS 分別為4 000、4 500、5 000、5 500 V；TEM 分別為150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 ℃；CUR 分別為20、25、30、35、40、45 psi；Gas 1 分別為40、45、50、55、60、65 psi；Gas 2 分別為40、45、50、55、60、65 psi；CAD 分別為低、中、高流速。通過比較不同條件下4 種免疫抑制劑的峰形及峰面積，確定最佳的質(zhì)譜參數(shù)。

1.3.4 標準品溶液及標準曲線的配制 用甲醇配制濃度為100 ng/mL 的4 種免疫抑制劑標準品混合溶液，用以評估流動相及離子源參數(shù)對于化合物色譜響應的影響。用甲醇分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL 的CsA、TaC、SiR 和EvE 標準品溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.5 結果分析 使用SCIEX 公司的定量軟件MultiQuant （V3.0） 對標準曲線的線性及準確度（accuracy）進行分析。其中，準確度表示標準曲線中各個樣品的理論濃度與實測濃度的接近程度，由MultiQuant（V3.0）軟件自動計算（一般要求各標準品濃度點的準確度在100%±15%范圍內(nèi)，最低濃度點在100%±20%范圍內(nèi)）。使用GraphPad Prism 6 軟件繪制質(zhì)譜參數(shù)對于免疫抑制劑色譜峰峰面積影響的折線圖。

2 結果

2.1 免疫抑制劑MRM定量離子對的確定

采用MRM 正離子模式，對4 種免疫抑制劑進行定量分析。為了確定免疫抑制劑的MRM 定量離子對信息，使用針泵直接推注標準品的進樣方式，對4 種免疫抑制劑分別進行一級、二級質(zhì)譜信息采集，從而獲取4 種免疫抑制劑的Q1 和Q3 碎片信息，并針對每個化合物分別優(yōu)化去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、碰撞室出口電壓（collision cell exit potential，CXP）等參數(shù)，最終確定用于定量檢測的MRM 離子對，結果見表1。該結果將用于后續(xù)建立LC-MS/MS 定量檢測方法。

表1 4種免疫抑制劑MRM方法參數(shù)Tab 1 Parameters of MRM method of four immunosuppressant drugs

2.2 流動相對免疫抑制劑定量分析的影響

不同有機相及緩沖鹽體系對免疫抑制劑定量檢測的影響主要通過峰寬和色譜峰響應來評價（圖1）。結果表明，與乙腈相比，甲醇作為有機相能夠明顯減小峰寬、改善峰形。例如，有機相由乙腈更換為甲醇時，CsA 色譜峰峰寬由0.70 min 縮短至0.31 min，TaC 色譜峰峰寬由0.93 min 縮短至0.61 min，且色譜峰峰形得到一定程度的改善。為了進一步改善峰形、提高色譜峰響應，以甲醇（含0.1%FA）為有機相，在水相（含0.1%FA）中添加了5 mmol/L 的AF。結果發(fā)現(xiàn)AF 的添加能夠顯著提高色譜峰響應并改善峰形。

圖1 4種免疫抑制劑在不同流動相體系下色譜峰峰形及色譜響應的比較Fig 1 Comparison of chromatographic peak shapes and chromatographic responses of four immunosuppressant drugs under different mobile phase systems

含不同濃度AF 及AA 的緩沖鹽體系對免疫抑制劑定量分析影響的結果見表2。同AA相比，含AF的流動相體系下，色譜峰的響應相對更高。此外，無論是AF 還是AA，隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜峰信號并沒有進一步提高。相反，高濃度緩沖鹽反而會一定程度抑制色譜峰響應。因此，最終選擇在水相中添加5 mmol/L的AF開展后續(xù)的優(yōu)化實驗。

表2 不同緩沖鹽體系對4種免疫抑制劑色譜峰的影響Tab 2 Influence of different buffer salt systems on the chromatographic peaks of four immunosuppressant drugs

2.3 質(zhì)譜參數(shù)對免疫抑制劑定量檢測的影響

優(yōu)化流動相體系雖然能夠提高免疫抑制劑色譜峰響應，但色譜峰峰形仍有待優(yōu)化。為了改善峰形，提高定量的準確性，分別優(yōu)化了IS、TEM、CUR、Gas 1、Gas 2、CAD 等離子源參數(shù)（圖2）。結果表明，隨著IS升高，免疫抑制劑色譜峰響應逐漸增強（圖2A）；TEM對免疫抑制劑色譜峰響應影響顯著，在100～600 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，色譜峰響應呈現(xiàn)先增后減的趨勢（圖2B）；隨著CUR 的增加，色譜峰響應降低（圖2C）；Gas 1 和Gas 2 對4 種免疫抑制劑響應的影響并不明顯，在40～65 psi 的范圍內(nèi)，色譜峰響應幾乎不受影響（圖2D、E）；CAD 對4 種免疫抑制劑響應的影響趨勢不同，對SiR 和EvE 的影響較大，在CAD 低流速時為最優(yōu)（圖2F）。

圖2 質(zhì)譜離子源參數(shù)對4種免疫抑制劑色譜峰響應的影響Fig 2 Influence of mass spectrometry ion source parameters on the chromatographic peak response of four immunosuppressant drugs

在質(zhì)譜離子源參數(shù)中，TEM 對4 種免疫抑制劑的色譜峰響應影響最為明顯（圖2）。在500～600 ℃時（0.5 mL/min 流速下通常設置的TEM 范圍），4 種免疫抑制劑的色譜峰響應反而最低。CsA、SiR、TaC 及EvE 的最優(yōu)TEM 范圍分別為150～200 ℃、200～250 ℃、250～300 ℃、200～250 ℃。對于CsA 來說，溫度的改變能夠造成色譜峰響應值呈2～3 個數(shù)量級的變化（圖2B）。此外，溫度的改變對免疫抑制劑峰形的影響極大，隨著溫度的降低，色譜峰峰形得到明顯改善（圖3）。其中，CsA 的峰形變化尤為顯著：TEM 為500 ℃時，色譜峰呈多分叉狀；溫度降低至300 ℃時，色譜峰峰形得到一定程度的改善；而溫度降低至100～250 ℃時，色譜峰呈平滑無分叉的對稱峰。

圖3 質(zhì)譜TEM對4種免疫抑制劑色譜峰峰形的影響Fig 3 Influence of mass spectrometry TEM on the chromatographic peak shape of four immunosuppressant drugs

為了進一步確定TEM 對免疫抑制劑定量的影響，我們考察了不同TEM 設置（250 ℃和550 ℃）對4 種免疫抑制劑標準曲線的線性及定量靈敏度LOQ 的影響。結果見圖4。250 ℃時，4 種免疫抑制劑的標準曲線線性良好（圖4A），除EvE 外，r2均大于0.99，且定量準確度高（85%～115%）。此外，4 種免疫抑制劑的LOQ 均能達到0.05 ng/mL［信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）＞10］，遠高于已有文獻報道［16-18，26］，表明定量靈敏度得到顯著改善；而550 ℃時，4 種免疫抑制劑的標準曲線線性相對較差且標準曲線各個濃度點的準確度不能滿足85%～115%的可容忍范圍。此時，相較于250 ℃，CsA 和SiR的濃度達到0.1 ng/mL 時，才能滿足S/N＞10，即定量靈敏度降低。因此，TEM 過高時（550 ℃）時，4 種免疫抑制劑的定量靈敏度和準確度均降低；TEM 對免疫抑制劑定量結果影響顯著，在方法優(yōu)化時不容忽視。綜上，在甲醇（含0.1% FA）-水（含0.1% FA 及5 mmol/L AF）的色譜條件下，免疫抑制劑定量分析方法的最優(yōu)質(zhì)譜離子源參數(shù)設置為：IS=5 500 V，TEM=250 ℃，CUR=20 psi，Gas 1=65 psi，Gas 2=45 psi，CAD=低流速。

圖4 TEM對4種免疫抑制劑標準曲線線性的影響Fig 4 Influence of TEM on the standard curve linearity of four immunosuppressant drugs

3 討論

近幾年來，LC-MS/MS 作為定量檢測手段應用于免疫抑制劑的分析已較為成熟。例如，Gong 等［18］開發(fā)了結合樣品前處理一步蛋白沉淀法的LC-MS/MS 分析方法，可實現(xiàn)樣品前處理的簡單化、短時間梯度（7 min）以及較高靈敏度（CsA、SiR、TaC、EvE 的LOQ 分別為5.0、0.5、0.5、0.5 ng/mL）［18］；Krná?等［17］進一步縮短了洗脫梯度（3.5 min），從而提高了檢測效率等。盡管目前已經(jīng)有非常多的報道將LC-MS/MS 應用于免疫抑制劑定量檢測項目中，然而免疫抑制劑定量檢測需要開發(fā)更高靈敏度的定量分析方法，且至今尚沒有報道系統(tǒng)評價色譜質(zhì)譜參數(shù)對免疫抑制劑定量分析的影響。Krná? 等［17］僅評價了流動相中添加不同濃度的AF 對免疫抑制劑響應的影響。本研究針對LC-MS/MS 方法中主要的參數(shù)進行系統(tǒng)考察，包括流動相、流動相添加劑、IS、TEM、Gas 1、Gas 2、CAD 等。通過改變不同的參數(shù)設置，來系統(tǒng)評估并優(yōu)化免疫抑制劑定量分析的關鍵因素。

FA、AF 和AA 是常用的流動相添加劑，較低濃度（≤0.05%體積分數(shù)）的FA 能夠增強大多數(shù)化合物在正離子模式下的質(zhì)譜響應［16-18］。此外，在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜方法時，我們發(fā)現(xiàn)AF 或AA 的添加能夠明顯增強免疫抑制劑色譜峰響應；隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜響應反而受到抑制，這與流動相PH 值及化合物本身的pKa 值有關［27］。在本研究中，TEM 是影響免疫抑制劑定量分析的最主要因素。對于ESI 離子源，其TEM 的設置在一定的范圍內(nèi)與流速呈正相關。例如，在0.4～0.5 mL/min的流速下，該色譜-質(zhì)譜體系匹配的TEM 通常為500～600 ℃。然而，對于免疫抑制劑來說，較高的TEM（500～600 ℃）能夠導致峰形變差且抑制色譜峰響應，隨溫度升高其抑制作用更為明顯，從而最終影響定量的準確性。在200～300 ℃之間，4 種免疫抑制劑的色譜峰響應最高（圖2），這與Gong等［18］的方法描述一致（TEM 為300 ℃）。除流速以外，ESI 的TEM 還與流動相組成及化合物的特性相關。通常，TEM 升高能夠加快帶電液滴表面的溶劑揮發(fā)，從而能夠更快地到達Rayleigh 極限，因此在相同時間內(nèi)能夠產(chǎn)生更多的氣相離子從而增加檢測的靈敏度。然而，當有機相比例較高時，相對較低的TEM 已經(jīng)足夠使得帶電液滴氣化［24］。由于CsA 等這4種免疫抑制劑水溶性差，其在高甲醇比例時出峰，因此可能僅需要較低的TEM 即可滿足氣化。

綜上所述，我們探究了CsA、SiR、TaC 以及EvE 4種免疫抑制劑在UPLC-MS/MS 定量分析中的主要色譜和質(zhì)譜參數(shù)對定量分析的影響，改善了免疫抑制劑定量檢測的靈敏度和準確性。此外，也為其他化合物的質(zhì)譜定量方法開發(fā)和優(yōu)化提供了新的思路。