李 麗，唐國(guó)毅，馮賀龍，薛玉涵，任 助，王國(guó)康，賈妙妙，商 雨,2,3，羅青平,2,3，邵華斌,2,3，溫國(guó)元,2,3*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3.畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064)

H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)在自然界中廣泛存在與傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，也嚴(yán)重影響到了公共衛(wèi)生安全。H9亞型 AIV屬于低致病性禽流感病毒(low-pathogenic AIV,LPAIV)，家禽對(duì)其高度易感，能夠造成呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量急劇下降等，但死亡率不高，與其他病原體混合感染后，發(fā)病及死亡率會(huì)顯著提升[1-5]。

目前在全世界流行的H9亞型AIV主要分為北美和歐亞兩大譜系，歐亞譜系進(jìn)一步發(fā)展形成不同的病毒群，如A/chicken/Beijing/1/1994(BJ/94-like)，A/duck/Hong Kong/Y280/1997(Y280-like)，A/quail/Hong Kong/G1/1997(G1-like)，A/duck/Hong Kong/Y439/1997(Y439-like)和A/chicken/Shanghai/F/1998(F/98-like)等[6-8]。與中亞和中東地區(qū)的H9亞型AIV相比，中國(guó)分離株在HA和NA基因的進(jìn)化樹中屬于獨(dú)立分支[8]。在我國(guó)，G1-like主要在南方地區(qū)的鵪鶉中流行，BJ/94-like和F/98-like分別在北方和東部地區(qū)雞群中流行[8-9]。國(guó)內(nèi)對(duì)H9亞型AIV的防控以免疫預(yù)防為主，目前市場(chǎng)上的H9禽流感疫苗以滅活疫苗為主[10]，盡管有很多H9亞型禽流感滅活疫苗在應(yīng)用，但H9亞型禽流感疫情仍然沒有得到有效控制。近年來，H9N2亞型AIV在免疫雞群中有較高的分離率，病毒在免疫壓力、自身變異等多因素作用下發(fā)生了抗原漂移，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗的免疫保護(hù)效力降低[11-14]。H9亞型AIV的基因重組、變異不僅給當(dāng)前禽流感的防控工作帶來了困難，也對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在的威脅[15-16]，迫切需要研發(fā)一種具有廣泛交叉保護(hù)作用的H9亞型禽流感疫苗。

馬賽克(mosaic)疫苗主要是針對(duì)抗原表位多變的病毒免疫原性蛋白，設(shè)計(jì)抗原表位覆蓋率高的免疫原性蛋白基因序列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)高度變異的病毒產(chǎn)生通用免疫保護(hù)作用[17]。該技術(shù)利用遺傳算法將所有目的蛋白序列中潛在的抗原表位整合至一條新的目的蛋白序列，使其可提供比其他野生型蛋白更為廣泛的流行變異株免疫保護(hù)。本研究設(shè)計(jì)并合成了H9亞型 AIVHA基因的mosaic序列，采用反向遺傳操作技術(shù)，以mosaicHA序列替換H1N1亞型流感病毒PR8株的HA片段，獲得了重組禽流感病毒rPR8-HAm/H9株，并在SPF雛雞上評(píng)價(jià)了其作為滅活疫苗的免疫保護(hù)效果，為后續(xù)H9亞型禽流感通用疫苗的開發(fā)提供了新的思路和方法，可為廣譜禽流感疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌(毒)株、載體、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

H9N2亞型禽流感毒株A/chicken/JM0305/2017(簡(jiǎn)稱JM0305)為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；表達(dá)質(zhì)粒PHW2000及包含有H1N1亞型流感病毒PR8株7個(gè) 基因的重組質(zhì)粒PHW2000-PB2、PHW2000-PB1、PHW2000-PA、PHW2000-NP、PHW2000-NA、PHW2000-M和PHW2000-NS均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；犬腎細(xì)胞(MDCK)和人源胚胎腎細(xì)胞(HEK-293T)由本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；SPF雞由本實(shí)驗(yàn)室孵化，隔離器飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

2×Phata Max Master Mix，2 ×Rapid Taq Master Mix，ClonExpress Ⅱ DNA連接酶，HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix均購(gòu)自諾唯贊公司；SmaⅠ、BamH Ⅰ、ScaⅠ、DpnⅠ等限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自Gibco公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；動(dòng)物免疫佐劑MERCKINADE SDA25購(gòu)自美國(guó)默凱納-萬諾公司。

1.3 Mosaic HA序列(HAm/H9)的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了總計(jì)3 957條H9 亞型AIV的HA氨基酸序列，剔除不完整和多余的序列，最終將2 219條序列上傳至馬賽克疫苗設(shè)計(jì)網(wǎng)站(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/MOSAIC/makeVaccine.html)，設(shè)計(jì)Mosaic HA序列[18]，參數(shù)選項(xiàng)中Cocktail Size設(shè)置為“1”，以產(chǎn)生一個(gè)單一的肽，即為HAm/H9。閾值設(shè)置為“3”，表位長(zhǎng)度參數(shù)被設(shè)置為12-mer，與天然T細(xì)胞表位的長(zhǎng)度匹配[19]。利用BepiPred 1.0 Serve和NetTepi 1.0 Serve分別預(yù)測(cè)HAm/H9序列及H9亞型AIV各分支代表株HA序列的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。將HAm/H9基因由生工生物公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒拯救

將HAm/H9序列插入至PHW2000表達(dá)質(zhì)粒，參照HAm/H9和PHW2000的序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，通過引物延伸PCR方法，在插入片段HAm/H9的兩端分別引入其與PHW2000質(zhì)粒連接處的同源臂(長(zhǎng)度為15 bp)，利用In-fusion克隆連接技術(shù)，構(gòu)建并獲得重構(gòu)質(zhì)粒PHW2000-HAm/H9。

利用LipofectamineTM3000將質(zhì)粒PHW2000-PB2、PHW2000-PB1、PHW2000-PA、PHW2000-HAm/H9、PHW2000-NP、PHW2000-NA、PHW2000-M、PHW2000-NS共轉(zhuǎn)染至混合培養(yǎng)有MDCK和HEK-293T細(xì)胞的6孔板中，48 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)基上清，反復(fù)凍融后接種9日齡SPF雞胚，收取HA陽性的樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析，將鑒定正確的重組病毒命名為rPR8-HAm/H9。

1.5 重組病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將重組病毒以0.1 MOI接種于MDCK細(xì)胞，于12、24、36、48、60、72 h收取細(xì)胞上清測(cè)定病毒滴度，記錄細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench公式計(jì)算病毒的TCID50，繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。

1.6 重組病毒的免疫原性測(cè)定

1.6.1 滅活疫苗的制備與免疫 將重組病毒rPR8-HAm/H9株及JM0305株病毒尿囊液稀釋至108EID50·0.1 mL-1，以終濃度為0.1%的甲醛滅活。滅活完全的病毒液以3∶1質(zhì)量比加入動(dòng)物免疫佐劑，低速攪拌至滅活疫苗完全乳化。

選取1周齡SPF雛雞，分為A、B、C、D、E、F組，每組12羽。A組和B組通過肌內(nèi)注射的方式免疫JM0305株，注射劑量0.1 mL·只-1；C組和D組以相同方式和劑量的免疫rPR8-HAm/H9株。E組和F組為PBS對(duì)照組。首免兩周后，每組隨機(jī)采集血清5份，同時(shí)對(duì)所有試驗(yàn)組進(jìn)行加強(qiáng)免疫，接種途徑和劑量不變。加強(qiáng)免疫后14 d，每組隨機(jī)采集血清5份。

1.6.2 血凝抑制(HI)抗體測(cè)定 分別以rPR8-HAm/H9株及JM0305株配制四單位抗原，測(cè)定采集血清的HI抗體水平。

1.6.3 中和抗體測(cè)定 將血清進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋，與等體積病毒液(100 TCID50·0.1 mL-1)混合，置于適當(dāng)?shù)臈l件下感作一段時(shí)間后，取混合液0.2 mL接種生長(zhǎng)在96孔板的MDCK細(xì)胞，觀察記錄接種細(xì)胞的病變情況，計(jì)算出能夠使50%的細(xì)胞培養(yǎng)孔不發(fā)生病變的血清最高稀釋度，即為該血清的中和效價(jià)。

1.6.4 攻毒保護(hù)效果 加強(qiáng)免疫后14 d，采取滴鼻點(diǎn)眼方式，分別用rPR8-HAm/H9株(A、C、E組)及JM0305株(B、D、F組)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒劑量為106EID50·只-1。攻毒后，觀察SPF雞健康狀況，如出現(xiàn)精神沉郁、嗜睡，采食量、飲水量減少、腹瀉等狀況，則判定其感染發(fā)病。分別于攻毒后第3、5、7天從各組隨機(jī)采集10只雛雞的喉頭、泄殖腔拭子，作除菌處理后以100 μL·枚-1接種9日齡SPF雞胚3枚，置37 ℃培養(yǎng)72 h，收取尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)，以3枚之一出現(xiàn)HA≥24作為攻毒不保護(hù)的判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)病毒感染為陰性的雞胚尿囊液應(yīng)該盲傳一代，再次確認(rèn)HA效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 HAm/H9序列抗原表位預(yù)測(cè)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載得到2 219條完整的H9亞型AIVHA基因序列，以其作為背景蛋白集，通過在線設(shè)計(jì)的方式，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成了一條H9亞型AIV的mosaicHA基因序列HAm/H9。利用在線軟件BepiPred 1.0 Serve及NetTepi 1.0 Serve，預(yù)測(cè)了HAm/H9蛋白序列的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，將其在HAm/H9蛋白序列中進(jìn)行了標(biāo)注(圖1)。同時(shí)，對(duì)H9亞型AIV的各進(jìn)化分支代表毒株的HA基因抗原表位也進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果如表1所示，相較于其他代表毒株，HAm/H9涵蓋了最多的潛在抗原表位，其中B細(xì)胞表位有36個(gè)，T細(xì)胞表位有45個(gè)。

圖1 HAm/H9蛋白的抗原表位分析結(jié)果Fig.1 The map of HAm/H9 protein epitopes

表1 H9亞型禽流感病毒的HA及HAm/H9序列的抗原表位比較Table 1 Prediction of epitopes about HAm/H9 and HA genes of representative strains

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒拯救

通過PCR擴(kuò)增獲得插入片段HAm/H9和載體片段PHW2000，以1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，目的條帶大小與預(yù)期相符，分別為1 700和3 090 bp(圖2)。通過In-fusion克隆方式，將插入片段與載體片段連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果正確，重組表達(dá)質(zhì)粒PHW2000-HAm/H9構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.PHW2000;2.HAm/H9M.DL5000 DNA marker;1.PHW2000;2.HAm/H9圖2 線性化載體PHW2000和插入片段HAm/H9的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of PHW2000 and HAm/H9

采用“7+1”反向遺傳操作系統(tǒng)，將PHW2000-HAm/H9重組質(zhì)粒與PR8株的7個(gè)基因(除HA外)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293T和MDCK混養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞產(chǎn)生病變，收取細(xì)胞反復(fù)凍融，接種9日齡 SPF雞胚，RT-PCR方法檢測(cè)HA陽性尿囊液中重組病毒的HAm/H9基因，目的條帶大小約為1 800 bp(圖3)，與預(yù)期一致，測(cè)序結(jié)果正確，表明重組病毒拯救成功，命名為rPR8-HAm/H9。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3.不同HA陽性尿囊液PCR擴(kuò)增結(jié)果;4.陰性對(duì)照M.DL2000 DNA marker;1-3.PCR amplification of HA positive allantoic fluid;4.Negative control圖3 RT-PCR鑒定重組病毒rPR8-HAm/H9Fig.3 Identification of recombinant virus rPR8-HAm/H9 by RT-PCR

2.3 重組病毒的生長(zhǎng)曲線

將重組病毒rPR8-HAm/H9株及PR8親本株分別以0.1 MOI接種于含有MDCK單層細(xì)胞的96孔 板，分別于12、24、36、48、60、72 h取上清測(cè)定病毒滴度，繪制兩株病毒的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，重組病毒rPR8-HAm/H9株和PR8親本株在感染MDCK細(xì)胞后60～72 h達(dá)到平臺(tái)期，滴度分別是106.0、105.4TCID50· mL-1(圖4)，重組病毒的細(xì)胞增殖滴度略高于PR8親本株。

圖4 rPR8-HAm/H9及PR8株在MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth kinetics of rPR8-HAm/H9 and PR8 in MDCK cell

2.4 重組病毒的免疫原性

評(píng)估了重組病毒作為H9亞型禽流感滅活疫苗在SPF雞上的免疫原性，分別在首免(primary immune)和二免(secondary immune)兩周后采集血清，用兩種病毒的四單位抗原以HI法測(cè)定血清的抗體水平，同時(shí)檢測(cè)免疫血清的中和抗體水平，并在二免后2周分別用rPR8-HAm/H9和JM0305進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)攻毒后的發(fā)病情況和排毒情況，綜合分析重組病毒滅活疫苗的免疫原性。

2.4.1 HI抗體 分別以兩種病毒(rPR8-HAm/H9株和JM0305株)配制四單位抗原，以HI法測(cè)定各試驗(yàn)組雞血清的AIV HI抗體水平，結(jié)果如圖5所示，rPR8-HAm/H9滅活疫苗加強(qiáng)免疫2周后，以兩種抗原測(cè)定的HI結(jié)果分別為25.6(rPR8-HAm/H9)和24(JM0305)。JM0305滅活疫苗加強(qiáng)免疫2周后血清抗體水平分別為26(JM0305)和23(rPR8-HAm/H9)。與首次免疫的抗體水平相比，JM0305免疫組針對(duì)rPR8-HAm/H9的抗體結(jié)果沒有顯著變化。結(jié)果表明rPR8-HAm/H9免疫組的血清與JM0305株具有較好的交叉反應(yīng)。

2.4.2 中和抗體 采取固定病毒稀釋血清的方法測(cè)定各試驗(yàn)組血清的中和抗體效價(jià)，結(jié)果如表2所示，rPR8-HAm/H9滅活疫苗免疫組的血清對(duì)自身中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶22，對(duì)JM0305株的中和抗體效價(jià)為1∶10。JM0305株的血清對(duì)自身中和抗體效價(jià)為1∶16，對(duì)rPR8-HAm/H9株的血清中和抗體效價(jià)為1∶2。結(jié)果表明rPR8-HAm/H9免疫組可產(chǎn)生針對(duì)JM0305株的中和抗體。

A.首免；B.二免A.Primary immune;B.Secondary immune圖5 rPR8-HAm/H9及JM0305滅活疫苗免疫后抗體水平Fig.5 HI antibody after immunization of rPR8-HAm/H9 and JM0305 inactivated vaccine

表2 滅活疫苗免疫雞的中和抗體效價(jià)Table 2 Titer of neutralizing antibody in inactivated vaccine immunized chicken

2.4.3 攻毒保護(hù)效果 H9N2 AIV屬于低致病性禽流感病毒，感染后不會(huì)引起試驗(yàn)雞死亡，rPR8-HAm/H9免疫組用rPR8-HAm/H9株攻毒，所有SPF雛雞均未出現(xiàn)發(fā)病癥狀；用JM0305株攻毒，75%SPF雛雞未發(fā)病。JM0305免疫組分別使用JM0305和rPR8-HAm/H9攻毒時(shí)，SPF雛雞的發(fā)病率分別為10%和70%。排毒結(jié)果如表3所示，rPR8-HAm/H9免疫組用rPR8-HAm/H9及JM0305攻毒后僅在第3天的喉頭和泄殖腔有少量排毒，保護(hù)率分別為70%和80%。JM0305免疫組對(duì)rPR8-HAm/H9和JM0305的攻毒保護(hù)率分別為10%和50%。PBS對(duì)照組對(duì)rPR8-HAm/H9和JM0305的攻毒無保護(hù)作用，均可分離到病毒。綜上，無論是以同源還是異源病毒攻擊，rPR8-HAm/H9免疫后均可顯著降低雛雞的發(fā)病率和攻毒排毒率，提供了較好的交叉保護(hù)作用。

表3 攻毒后排毒檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of virus shedding post-challenge

3 討 論

H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，可持續(xù)在野禽和家禽種群內(nèi)和群間傳播，具有高度的遺傳多樣性，雖然此類病毒在家禽中的發(fā)病率和死亡率通常較低，但是會(huì)引起禽類產(chǎn)蛋下降、混合感染和繼發(fā)感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[20]。另外有研究表明，LPAIV通過基因重組增加了高致病性禽流感病毒的遺傳多樣性，甚至可能由于HA蛋白裂解位點(diǎn)堿性氨基酸的插入或者替換造成毒株致病力的增強(qiáng)[21-22]，因此降低H9N2 AIV的傳播對(duì)于禽流感防控具有重要意義。研究表明使用與當(dāng)?shù)氐牧餍兄昶ヅ湫圆患训囊呙缰暌部赡軙?huì)促進(jìn)AIV的變異進(jìn)化[23-25]。因此，為了更好地防控H9亞型禽流感，亟需研發(fā)具有較好交叉保護(hù)效果的高效、通用疫苗。

近些年，一種新的mosaic疫苗制備技術(shù)首先被應(yīng)用到人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗學(xué)領(lǐng)域，與自然分離株的基因序列相比，人工設(shè)計(jì)合成的mosaic HIV-1 Gag、Pol和Env序列擴(kuò)大了細(xì)胞免疫的廣度和深度，提供了更廣泛交叉保護(hù)[17，26]。其原因在于該技術(shù)分析選擇并整合所有的潛在抗原表位于一條完整基因序列中，以9～12個(gè)氨基酸為一個(gè)完整的抗原表位多肽，最大程度地覆蓋了病毒群體的抗原表位。據(jù)推測(cè)，這種拼接方法可以保留更多的結(jié)構(gòu)保守序列，使得mosaic序列具有更多的構(gòu)象表位[18，27]。該技術(shù)同樣適用于高度變異的禽流感病毒，已有研究證實(shí)mosaic H5 HA在小鼠和猴子體內(nèi)具有較好的免疫原性，可以預(yù)防H5N1亞型AIV多個(gè)分支毒株的感染[28-30]。

本研究?jī)?yōu)化設(shè)計(jì)了1條mosaic H9HA序列，以其替換PR8株的HA基因，拯救獲得1株重組H9N1禽流感病毒rPR8-HAm/H9株。將以重組病毒制備的滅活疫苗免疫SPF雛雞，加強(qiáng)免疫后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，檢測(cè)了免疫后的血清HI抗體、中和抗體及攻毒保護(hù)效果。結(jié)果表明，與自然分離的JM0305株滅活疫苗相比，rPR8-HAm/H9株滅活疫苗在交叉保護(hù)上顯示出較大的優(yōu)勢(shì)，它既可以對(duì)同源病毒rPR8-HAm/H9產(chǎn)生免疫保護(hù)，又可以對(duì)異源JM0305株產(chǎn)生保護(hù)，可顯著抑制攻毒后的排毒，保護(hù)率分別為70%和80%，具有較好的交叉保護(hù)效果。而JM0305株滅活疫苗免疫后雖然可以產(chǎn)生針對(duì)rPR8-HAm/H9株的HI抗體，但交叉保護(hù)效果差。

4 結(jié) 論

本研究制備了一種基于mosaic HA序列的H9亞型禽流感滅活疫苗，可對(duì)異源H9N2亞型AIV JM0305株提供較好的攻毒保護(hù)，表明其可作為潛在的H9亞型通用疫苗候選株，后續(xù)將通過毒株優(yōu)化和佐劑篩選，進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫原性，應(yīng)用更多的異源毒株測(cè)定其通用保護(hù)效果，為廣譜禽流感疫苗研發(fā)提供思路和參考。