孟 禎，孫夢(mèng)珂，許永得，秦 韜，任 喆

(福建農(nóng)林大學(xué) 福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

近年來(lái)，動(dòng)物傳染病一直是影響?zhàn)B殖業(yè)生產(chǎn)的重要原因，如口蹄疫、新城疫(Newcastle disease,ND)、布魯氏菌病、結(jié)核病、豬瘟等，給公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展帶來(lái)了極大的威脅[1-2]。ND作為全球流行動(dòng)物傳染病之一，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病[3-4]，具有病死率高、發(fā)病急、病情重等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害動(dòng)物健康，因此受到學(xué)者們的高度重視。

為預(yù)防、控制ND的發(fā)生和流行，使用疫苗接種是現(xiàn)階段最安全且高效的免疫預(yù)防手段。盡管ND疫苗在國(guó)內(nèi)已得到廣泛使用，該病仍時(shí)有發(fā)生，究其原因，除了免疫程序和方法執(zhí)行不到位之外，還包括NDV毒力和免疫原性的變異等因素[5]。研究表明，免疫佐劑常與疫苗配合使用，可以提高抗原的免疫原性，加速誘導(dǎo)免疫反應(yīng)應(yīng)答[6-8]，此外，還可降低對(duì)疫苗接種反應(yīng)差的畜禽的疫苗劑量和生產(chǎn)成本。在眾多免疫佐劑中，鋁鹽使用廣泛，然而，鋁佐劑不能刺激足夠的抗原免疫，對(duì)Th1輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫無(wú)增強(qiáng)作用，也無(wú)法很好地誘導(dǎo)黏膜免疫[9]。同時(shí)，隨著鋁佐劑的積累，腎功能、大腦以及骨組織也大受影響，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)綜合征和癡呆[10]，而以油基佐劑配制的油乳滅活苗和減毒活疫苗也存在局部注射部位反應(yīng)的問(wèn)題[11-12]，油佐劑越粘稠越不利于注射。盡管通常情況下礦物油基佐劑與獸用疫苗一起使用能夠提高效果，卻往往伴隨著嚴(yán)重的副作用，如局部肉芽腫、膿腫或發(fā)燒[13]。相比前二者，中藥多糖(polysaccharide)作為佐劑，無(wú)論是對(duì)特異性免疫還是非特異性免疫都有增強(qiáng)作用，同時(shí)，在安全性上由于天然多糖自身固有的高相容、無(wú)殘留、低毒性等特點(diǎn)，克服了鋁佐劑與油佐劑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)的缺陷[14]。因此，中藥多糖作為免疫佐劑備受關(guān)注，且逐漸成為疫苗佐劑的發(fā)展趨勢(shì)，在疫苗領(lǐng)域擁有巨大的潛力[15]。

余甘子(PhyllanthusemblicaLinn.)為大戟科、葉下珠屬木本植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，余甘子含有維生素、黃酮、皂苷、多酚及多糖等活性成分，具有抗氧化、降血糖、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗菌等作用[16-18]。多糖作為余甘子的主要成分之一，在抗氧化[19]和降血糖[20]方面都具有良好的治療作用，但有關(guān)余甘子多糖(Phyllanthusemblicapolysaccharide,PEP)的結(jié)構(gòu)表征及其免疫活性的報(bào)道較少，極大限制了PEP的深度開(kāi)發(fā)及利用。因此，本試驗(yàn)從余甘子中制備PEP，通過(guò)UV、FT-IR、SEM和HPLC對(duì)PEP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并以特異性抗體、INF-γ和IL-4的水平、脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)、T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的比值、免疫器官組織學(xué)觀察以及免疫器官指數(shù)為指標(biāo)，探討PEP對(duì)ND疫苗免疫效果的影響，為后續(xù)PEP的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

余甘子購(gòu)自福州晴百旺生物科技有限公司；雛雞飼料購(gòu)自正大集團(tuán)飼料廠；ND疫苗購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司(201903)；冰醋酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(20180315)；DEAE-52纖維素(4057-050)購(gòu)自英國(guó)Whatman公司；大孔吸附樹(shù)脂(D101)、PBS(P1000)、紅細(xì)胞裂解液(R1010)、雞外周血淋巴細(xì)胞分離液(P8740)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NDV抗體檢測(cè)試劑盒(JC76438)、雞血清IL-4檢測(cè)試劑盒(JC74228)、雞血清INF-γ檢測(cè)試劑盒(JC74118)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Anti-Chicken CD8α-PE(8220-09)、Anti-Chicken CD4-FITC(8210-02)購(gòu)自美國(guó)SouthernBiotech公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選取175只未經(jīng)免疫的1日齡健康河田雞，購(gòu)自福建省長(zhǎng)汀河田種雞場(chǎng)。

1.3 儀器設(shè)備

RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；Alphal-2LDplus型真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自德國(guó)Christ公司；IMP180恒溫箱和EVOS FLc倒置熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Allegra X-22R高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；V-1200型可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；Milli-Q Direct 8/16超純水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司；Infinite M200pro酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司；1400301S高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自Tomy Digital Biology公司；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)ACEA公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；S-4000場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡購(gòu)自荷蘭Philips公司。

1.4 余甘子多糖的制備

采用水提醇沉法[21]提取PEP，將脫水去核的余甘子洗凈，烘干后經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎成粉末，在100 ℃ 下用95%乙醇浸煮1 h，共3次。將浸煮后的余甘子粉末用紗布過(guò)濾、擰干后放入托盤(pán)烘干，加入雙蒸水在100 ℃下回流提取2 h，共3次。收集水提液離心除去多余雜質(zhì)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下減壓濃縮至原體積的三分之一，加入3倍體積的95%乙醇，于4 ℃靜置2 d后，棄上清，將沉淀物烘干、干燥、冷凍，即得余甘子粗多糖。采用Sevage法除去余甘子粗多糖中的蛋白質(zhì)，重復(fù)3次，經(jīng)減壓、濃縮、醇沉、離心后，收集沉淀，冷凍、干燥后即得除蛋白后的余甘子粗多糖。采用大孔吸附樹(shù)脂、DEAE-52陰離子交換層析柱進(jìn)一步分離純化后得到PEP。

1.5 余甘子多糖糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定干燥后PEP的糖含量。按5個(gè)梯度取0～1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 g·L-1)加入干燥試管中，補(bǔ)齊雙蒸水至2 mL，再加入1 mL苯酚溶液(5%)，充分震蕩后順試管壁加入5 mL 濃硫酸，震蕩混勻，沸水水浴加熱10 min。自然冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每管在490 nm處的OD值，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，將OD490 nm值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制1 g·L-1多糖溶液，同上述步驟操作后，在490 nm處測(cè)定其OD值，最后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品的濃度，并根據(jù)公式計(jì)算樣品的糖含量，糖含量=m1/m2×100%，其中，m1為樣品糖含量(mg)，m2為樣品總質(zhì)量(mg)。

1.6 多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

1.6.1 紫外光譜 用雙蒸水配制5 g·L-1的PEP溶液，以雙蒸水為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PEP的紫外吸收光譜。

1.6.2 紅外光譜 稱(chēng)取適量干燥的PEP，以1∶100的比例加入KBr粉末，在瑪瑙研缽中一起研磨均勻，壓片機(jī)壓成薄片后，用紅外光譜儀進(jìn)行掃描，檢測(cè)范圍為4 000～500 cm-1，并記錄紅外光譜。

1.6.3 單糖組成分析 稱(chēng)取PEP加入H2SO4水解，用NaOH調(diào)水解后的溶液pH至7，用雙蒸水稀釋配成多糖衍生化溶液，取多糖衍生化溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入甲醇溶液和NaOH溶液，混勻后在70 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后加入鹽酸中和，再用氯仿萃取溶液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，重復(fù)3次 萃取過(guò)程后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后待HPLC分析單糖組成。

1.6.4 掃描電鏡 用小藥匙取微量?jī)龈珊蟮腜EP樣品，粘著于帶有導(dǎo)電膠帶的金屬臺(tái)上，用離子濺射儀對(duì)樣品鍍上導(dǎo)電金粉，使用掃描電鏡在5.0 kv的加速電壓下對(duì)PEP的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并采集微觀圖像。

1.7 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將175只1日齡健康河田雞隨機(jī)分成5組，每組35只，分別為：空白對(duì)照組，疫苗對(duì)照組，PEP低劑量(PEP low-dose,PEP-L)組、PEP中劑量(PEP medium-dose,PEP-M)組、PEP高劑量(PEP high-dose,PEP-H)組。飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值滿足雛雞生長(zhǎng)需要，早晚各飼喂一次，自由飲水。除空白對(duì)照組外均用ND疫苗進(jìn)行免疫，每只0.5 mL，7日齡首免，并于28日齡二免。在首免和二免日，3個(gè)多糖試驗(yàn)組分別按照10、20、30 g·L-1的劑量進(jìn)行給藥，疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)3 d。

1.8 樣品采集與處理

1.8.1 NDV特異性抗體水平檢測(cè) 各組分別在7、14、21、28、35、42 和49日齡時(shí)，每組隨機(jī)選取5只 河田雞，心臟采血，待血液凝固析出血清后，分離出血清，5 000 r·min-1離心5 min后取上清，將NDV特異性抗體ELISA檢測(cè)試劑盒從4 ℃取出后回溫至室溫((25±2)℃)，在包被板中按順序加入50 μL倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，其余孔加入10 μL各組血清樣品，補(bǔ)齊樣品稀釋液至50 μL，同時(shí)另設(shè)空白孔(不加任何液體)，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)孵育30 min。各孔加入300 μL洗液，靜置20 s，甩干，并在吸水紙上拍干多余水分，重復(fù)上述操作5次。除空白孔外，各孔加入50 μL酶標(biāo)試劑，37 ℃孵育30 min。重復(fù)洗板5次，各孔依次加入50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，輕輕搖晃振蕩混勻，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)孵育10 min。各孔加入50 μL終止液，輕輕搖晃振蕩10 s。放入酶標(biāo)儀，450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值(空白孔調(diào)零)。依照標(biāo)準(zhǔn)孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，將各孔OD值帶入回歸方程，計(jì)算NDV特異性抗體水平。

1.8.2 IL-4和INF-γ水平檢測(cè) 各組分別在7、14、21、28、35、42 和49日齡時(shí)，每組隨機(jī)選取5只河田雞，心臟采血，待血液凝固析出血清后，分離出血清，5 000 r·min-1離心5 min后取上清，分別將雞IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒和INF-γ ELISA檢測(cè)試劑盒從4 ℃取出后回溫至室溫((25±2)℃)再使用，同“1.8.1”的ELISA步驟測(cè)定IL-4和INF-γ的水平。

1.8.3 PEP對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的影響 于21日齡和49日齡時(shí)，每組隨機(jī)選取5只 河田雞，心臟采抗凝全血1 mL，用等體積的全血及組織稀釋液稀釋全血。在離心管中加入適量分離液，將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方。離心后出現(xiàn)明顯分層：最上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層。吸取淋巴細(xì)胞于離心管中，加入10 mL PBS溶液，離心后棄上清，加入5 mL PBS溶液離心后棄上清，重復(fù)2次，細(xì)胞重懸備用，即得外周血淋巴細(xì)胞。將提取的細(xì)胞調(diào)整為5×106cell·mL-1，分別加入Anti-Chicken CD4-FITC 5 μL、Anti-Chicken CD8-PE標(biāo)記的單克隆抗體2 μL，4 ℃避光30 min，再用含1%胎牛血清的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，加入0.5 mL PBS重懸。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周抗凝全血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞含量，即可測(cè)定PEP對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的影響。

1.8.4 免疫器官處理

1.8.4.1 MTT法測(cè)定雞脾淋巴細(xì)胞的增殖：于21日齡 和49日齡時(shí)，每組隨機(jī)選取5只河田雞，放血處死后取出脾，去除周?chē)嘤嘟M織并使用生理鹽水洗凈，用濾紙將表面水分吸干后于無(wú)菌超凈臺(tái)操作，置于研缽研磨充分后加入PBS溶液混勻，經(jīng)200目過(guò)濾網(wǎng)篩過(guò)濾收集濾液于離心管中，1 500 r·min-1離心5 min后棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液37 ℃ 下裂解5 min，加入5 mL PBS溶液終止裂解，1 500 r·min-1離心5 min后棄上清，加入1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%雙抗)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cell·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)，44 h后各孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)，4 h后，2 500 r·min-1離心10 min，分離上清液，避免孔內(nèi)結(jié)晶掉落，倒扣在吸水紙上吸干多余液體，各孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，將96孔板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，保證孔內(nèi)結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)液在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其OD值，并根據(jù)公式計(jì)算雞脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(stimulation index,SI),SI=藥物刺激孔OD值 /空白對(duì)照孔OD值。

1.8.4.2 免疫器官指數(shù)：每組隨機(jī)取5只49日齡雞的脾、胸腺、法氏囊和肝，用濾紙吸干表面多余水分，置于電子天平中稱(chēng)重記錄，并按公式計(jì)算免疫器官指數(shù)，免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g)/體重(g)×100%。

1.8.4.3 免疫器官組織病理學(xué)觀察：每組隨機(jī)取5只 49日齡雞的脾、胸腺、法氏囊和肝，分別固定在4%甲醛溶液中。通過(guò)蘇木精-伊紅染色法(HE)染色進(jìn)行脾組織、胸腺、法氏囊和肝組織的病理學(xué)分析，并使用光學(xué)顯微鏡獲得顯微圖像。

1.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行ANOVA方差分析，同時(shí)采用Duncan’s法多重比較分析差異顯著性。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 余甘子多糖的分離純化

余甘子經(jīng)熱水浸提、醇沉后得到余甘子粗多糖，呈深棕色粉末狀，得率為(55.10±0.40)%；通過(guò)Sevage法脫蛋白后得到除蛋白粗多糖，呈深灰色粉末狀，得率為(30.43±2.18)%；經(jīng)DEAE-52層析柱分離后，洗脫曲線如圖1所示，可見(jiàn)一個(gè)明顯的單一對(duì)稱(chēng)峰，表明分離后的多糖成分較均一，因此，PEP的出峰時(shí)間主要在175～250 min內(nèi)，合并175～250 min 內(nèi)收集管的溶液，經(jīng)冷凍干燥后得到純化后的PEP，呈白色棉絮狀，得率(7.43±0.50)%。

圖1 PEP在DEAE-52離子交換柱色譜的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of PEP on DEAE-52 cellulose column

2.2 余甘子多糖的糖含量

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為y=1.479 3x-0.007 4，R2=0.998 8，表明濃度與其OD值呈良好線性關(guān)系，根據(jù)計(jì)算得到PEP的糖含量為(86.70±1.05)%。

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 余甘子多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外光譜分析 如圖3所示，PEP在280 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收峰，表明PEP中蛋白含量低。

圖3 PEP的紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of PEP

2.3.2 紅外光譜分析 如圖4所示，3 357.52 cm-1波長(zhǎng)處有O-H的強(qiáng)烈伸縮振動(dòng)吸收峰，2 927.94 cm-1處有C-H的伸縮振動(dòng)峰，這兩種吸收峰均為多糖化合物的特征吸收峰。在1 576.07 cm-1處有一吸收峰，代表多糖官能團(tuán)中O-H鍵的伸縮振動(dòng)。其中1 418.89 cm-1的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)或者具有結(jié)晶水的結(jié)構(gòu)，在1 073.21 cm-1波長(zhǎng)的吸收峰代表C-O-C和C-O-H的伸縮振動(dòng)，887.11 cm-1處的吸收峰表明可能含有α型的糖苷鍵。

圖4 PEP的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of PEP

2.3.3 單糖組成分析 如表1所示，PEP由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和巖藻糖4種單糖組成，其中，以葡萄糖含量最多，巖藻糖含量最少。根據(jù)結(jié)果計(jì)算出PEP的單糖組成摩爾比為：GlcA∶Glu∶Xyl∶Fuc=0.5∶8.3∶1.8∶0.3。

表1 余甘子多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of PEP %

2.3.4 掃描電鏡分析 如圖5所示，PEP的結(jié)構(gòu)較為規(guī)整，呈片狀分布且表面可見(jiàn)明顯多糖粒子，多糖粒子總體結(jié)構(gòu)致密。

圖5 PEP的掃描電鏡圖Fig.5 SEM image of PEP

2.4 PEP對(duì)NDV特異性抗體水平的影響

PEP在不同日齡下對(duì)NDV特異性抗體的影響如圖6所示。與疫苗對(duì)照組相比，PEP-M組和PEP-H組均顯著提高血清NDV特異性抗體水平(P<0.05)，而PEP-L組可提高血清NDV特異性抗體水平，但差異不顯著(P>0.05)。由此可見(jiàn)，PEP作為ND疫苗免疫佐劑可以在一定程度上增加特異性抗體，具有劑量依賴(lài)性。

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。下同Data are expressed as “Mean±S.E.”.Bars labelled with different letters are significantly different among groups (P<0.05),while same letter means no significant difference (P>0.05).The same as below圖6 PEP對(duì)不同日齡雞NDV特異性抗體水平的影響Fig.6 The effect of PEP on specific antibody of NDV in chickens at different ages

2.5 PEP對(duì)IL-4水平的影響

PEP在不同日齡下對(duì)IL-4水平的影響如圖7所示。與空白組和疫苗對(duì)照組相比，3個(gè)多糖試驗(yàn)組的IL-4濃度均顯著增高(P<0.05)。除35日齡外，PEP-H組的IL-4濃度均顯著高于PEP-M組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，PEP作為ND疫苗免疫佐劑可以在一定程度上增加IL-4的分泌水平且有劑量依賴(lài)性。

圖7 PEP對(duì)不同日齡雞IL-4水平的影響Fig.7 Effect of PEP on concentration of IL-4 in chickens at different ages

2.6 PEP對(duì)INF-γ水平的影響

PEP在不同日齡下對(duì)INF-γ水平的影響如圖8所示。與空白組和疫苗對(duì)照組相比，3個(gè)多糖試驗(yàn)組的INF-γ濃度均顯著增高(P<0.05)。與PEP-L組相比，PEP-M組和PEP-H組的INF-γ濃度顯著升高(P<0.05)。由此可見(jiàn)，PEP作為ND疫苗免疫佐劑可以在一定程度上增加INF-γ的分泌水平。

圖8 PEP對(duì)不同日齡雞INF-γ水平的影響Fig.8 Effect of PEP on concentration of INF-γ in chickens at different ages

2.7 PEP對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的影響

PEP在28和49日齡對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值的影響如圖9和圖10所示。除28日齡PEP-M組外，多糖試驗(yàn)組的CD4+/CD8+比值均顯著高于空白組和疫苗對(duì)照組(P<0.05)。28日齡時(shí)，PEP-L組與PEP-M組差異不顯著(P<0.05)，49日齡時(shí)呈現(xiàn)隨著劑量增加而上升的趨勢(shì)。

圖9 PEP對(duì)雞外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的影響Fig.9 Effects of PEP on CD4+/CD8+ of chicken peripheral blood T lymphocytes

a.空白組；b.疫苗對(duì)照組；c.PEP-L組；d.PEP-M組；e.PEP-H組a.Blank group;b.Vaccine control group;c.PEP-L group;d.PEP-M group;e.PEP-H group圖10 PEP 對(duì)雞外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+的影響Fig.10 Effects of PEP on CD4+ and CD8+ of T lymphocytes in peripheral blood of chicken

2.8 PEP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.8.1 脾T淋巴細(xì)胞增殖 PEP在28和49日齡對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響如圖11所示。28和49日齡時(shí)，PEP-M組和PEP-H組的脾T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著高于疫苗對(duì)照組和空白組(P<0.05)，表明PEP能夠促進(jìn)脾T淋巴細(xì)胞的增殖，且增殖效果與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖11 PEP對(duì)雞脾T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)的影響Fig.11 Effect of PEP on SI of T lymphocyte proliferation in chicken spleen

2.8.2 脾B淋巴細(xì)胞增殖 PEP在28和49日齡對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響如圖12所示。28和49日齡時(shí)，PEP-M組和PEP-H組的脾B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著高于疫苗對(duì)照組和空白組(P<0.05)，表明PEP能夠促進(jìn)脾B淋巴細(xì)胞的增殖，且增殖效果與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖12 PEP對(duì)雞脾B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)的影響Fig.12 Effect of PEP on SI of B lymphocyte proliferation in chicken spleen

2.9 PEP對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

在49日齡時(shí)，PEP對(duì)雞脾臟、胸腺、法氏囊和肝臟器官指數(shù)的影響如圖13所示。3個(gè)多糖試驗(yàn)組免疫器官指數(shù)顯著高于空白組和疫苗對(duì)照組(P<0.05)，免疫器官指數(shù)隨著藥物組濃度升高而上升，說(shuō)明PEP作為免疫佐劑能提升雞的免疫器官指數(shù)。

圖13 49日齡雞免疫器官指數(shù)Fig.13 Immune organ index of 49-day-old chicken

2.10 免疫器官組織病理學(xué)分析

于49日齡進(jìn)行脾、法氏囊、胸腺和肝的組織學(xué)分析，并在200倍放大倍數(shù)下拍攝顯微圖像(圖14)。與空白組和疫苗對(duì)照組相比，脾切片中，PEP-M組和PEP-H組脾小結(jié)數(shù)量增多且面積增大；法氏囊切片中，3個(gè)劑量多糖組法氏囊小結(jié)髓質(zhì)密度均增加；胸腺切片中，PEP-H組胸腺小體數(shù)量增多，淋巴小結(jié)生發(fā)中心密度增加；肝切片中，肝細(xì)胞排列更加緊密整齊呈條索狀，彌散淋巴組織和肝血竇增多。以上結(jié)果表明，PEP可以促進(jìn)脾、法氏囊、胸腺和肝的免疫功能。

圖14 PEP對(duì)脾、法氏囊、胸腺和肝影響的組織病理學(xué)分析(200×)Fig.14 Histopathological analysis of the effects of PEP on the spleen,bursa,thymus and liver (200×)

3 討 論

3.1 余甘子多糖的結(jié)構(gòu)表征與功能關(guān)系分析

采用水提醇沉法提取余甘子粗多糖，通過(guò)DEAE-52纖維素柱層析法進(jìn)行分離純化，得到的PEP糖含量為(86.70±1.05)%。研究表明，多糖的結(jié)構(gòu)與其生物活性具有密切關(guān)系，因此，本試驗(yàn)對(duì)PEP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。UV結(jié)果顯示，PEP在280 nm 波長(zhǎng)處均無(wú)明顯的吸收峰，表明PEP中的蛋白質(zhì)含量較低。FT-IR結(jié)果顯示，PEP含有多糖化合物的特征吸收峰，證明PEP為多糖類(lèi)物質(zhì)，與PEP的理化性質(zhì)研究結(jié)果一致。單糖組成結(jié)果顯示，PEP由GlcA、Glu、Xyl和Fuc組成，摩爾比為0.5∶8.3∶1.8∶0.3，PEP包含多種不同單糖而具有不同程度的主干以及分支結(jié)構(gòu)。SEM可觀察材料表面形貌，顯示PEP的結(jié)構(gòu)較為規(guī)整，呈片狀分布且表面可見(jiàn)多糖粒子，多糖總體結(jié)構(gòu)致密，與機(jī)體接觸面積較大。

3.2 余甘子多糖增強(qiáng)免疫活性分析

抗體是B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白，主要存在于血清等體液中介導(dǎo)體液免疫，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，作為免疫調(diào)控因子發(fā)揮作用[22]。研究表明，中藥多糖類(lèi)物質(zhì)可提高雛雞NDV的特異性抗體水平[23-24]。劉寬輝等[25]研究發(fā)現(xiàn)，硒化黨參多糖和大蒜多糖可協(xié)同提高ND疫苗的血清抗體效價(jià)，增強(qiáng)免疫活性。因此，NDV特異性抗體水平可反映疫苗的使用效價(jià)，同時(shí)還能反映出動(dòng)物機(jī)體體液免疫強(qiáng)度。在本研究中，與空白組和疫苗對(duì)照組相比較，PEP-M組和PEP-H組的血清NDV特異性抗體水平均提高，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系，表明PEP作為ND疫苗免疫佐劑能提高其體液免疫水平。此外，PEP發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。以上結(jié)果證明PEP可以作為免疫佐劑，能長(zhǎng)期、持續(xù)提高雛雞血清NDV特異性抗體水平。

活化的免疫細(xì)胞可以分泌一些在免疫應(yīng)答中起重要作用的蛋白質(zhì)或小分子多肽，稱(chēng)為細(xì)胞因子。細(xì)胞因子主要有白介素(interleukin,IL)以及干擾素(interferon,IFN)等。IL-4可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，還可以協(xié)同集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)誘導(dǎo)血細(xì)胞的增殖[26]。IFN-γ作為Ⅱ型干擾素，來(lái)源于T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和殺傷細(xì)胞的活性，還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性，調(diào)節(jié)免疫的自身穩(wěn)定功能[27]。研究表明，中藥多糖能不同程度地促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ等的分泌，可作為免疫佐劑增強(qiáng)對(duì)口蹄疫疫苗[28]、圓環(huán)病毒疫苗[29]和ND疫苗[30]的免疫效果。本研究發(fā)現(xiàn)，PEP能提高IL-4和IFN-γ的分泌水平，且存在劑量依賴(lài)性，表明PEP能有效提高機(jī)體細(xì)胞因子的分泌水平。

T淋巴細(xì)胞作為免疫細(xì)胞群，可通過(guò)受體識(shí)別并結(jié)合MHCⅠ類(lèi)或MHCⅡ類(lèi)分子相關(guān)的抗原，并分別表達(dá)CD4+和CD8+分子對(duì)抗入侵病毒[31]，可見(jiàn)T淋巴細(xì)胞的分化出的亞群和機(jī)體免疫高度相關(guān)。CD4+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，反應(yīng)機(jī)體免疫力，不僅可以使浸潤(rùn)腫瘤的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)目增加，還能增強(qiáng)殺傷力，在數(shù)量、質(zhì)量?jī)煞矫娑加刑岣撸诰S持小鼠的免疫記憶方面也有著重要作用[32-33]。已有研究表明，灰樹(shù)花多糖可使Th2細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使CD4+/CD8+T細(xì)胞比值降低[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PEP作用于雛雞后，外周血中CD4+/CD8+值高于疫苗對(duì)照組，這表明PEP能夠提高CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)可強(qiáng)化對(duì)B細(xì)胞的增殖、分化和成熟的誘導(dǎo)，進(jìn)而增強(qiáng)雛雞對(duì)NDV疫苗的特異性免疫應(yīng)答以及抗體的產(chǎn)生。

3.3 余甘子多糖對(duì)免疫器官的影響

脾、法氏囊、胸腺和肝都是雞體內(nèi)重要的免疫器官，免疫器官指數(shù)反映其發(fā)育程度，進(jìn)而體現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[35]。ND可導(dǎo)致雞各組織器官出現(xiàn)廣泛性病變，尤其以免疫器官病變最為明顯，可見(jiàn)胸腺小葉皮質(zhì)區(qū)出血、髓質(zhì)區(qū)可見(jiàn)較多出血灶或視野可見(jiàn)血漿滲出物；脾淋巴細(xì)胞變性壞死、數(shù)量極度減少、髓質(zhì)部有不同程度的充血和淤血；法氏囊濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞嚴(yán)重變性壞死，數(shù)量減少，間質(zhì)小血管出現(xiàn)擴(kuò)張或充血[36]。因此，選取胸腺、法氏囊、脾和肝的發(fā)育情況來(lái)衡量雞免疫功能的強(qiáng)弱。

脾是體內(nèi)最大的免疫器官，由大量淋巴細(xì)胞組成[37]，是免疫反應(yīng)的主要部位，侵入血內(nèi)的病原體，如細(xì)菌、瘧原蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)等，可引起脾內(nèi)發(fā)生免疫應(yīng)答，脾的體積和結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化。脾小結(jié)位于動(dòng)脈周?chē)馨颓实囊粋?cè)，主要由B細(xì)胞構(gòu)成，當(dāng)受到抗原刺激引起體液免疫應(yīng)答時(shí)，脾小結(jié)數(shù)量增多，面積增大。本試驗(yàn)脾組織學(xué)切片可見(jiàn)，與空白組和疫苗對(duì)照組相比，PEP-M組和PEP-H組脾小結(jié)數(shù)量增多且面積增大。

法氏囊為家禽特有的中樞淋巴器官，是一個(gè)卵圓形的囊狀器官，位于泄殖腔的背側(cè)，其黏膜組織結(jié)構(gòu)中的髓質(zhì)由上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞、較幼稚的(大、中型)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成。本試驗(yàn)法氏囊切片可見(jiàn)，與空白組和對(duì)照組相比，3個(gè)劑量多糖組法氏囊小結(jié)髓質(zhì)密度均增加。

胸腺為中樞淋巴器官，具有培育和選擇T細(xì)胞、分泌激素和細(xì)胞因子的功能。胸腺小體是一種特殊的胸腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，大小不一，散在分布于髓質(zhì)內(nèi)，由扁平胸腺上皮細(xì)胞呈同心圓狀包繞而成，具有一定的免疫學(xué)作用和吞噬功能，參與胸腺細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)和細(xì)胞清除，尤其在胸腺樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)中度到高度新合性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的次級(jí)陽(yáng)性選擇中，胸腺小體具有關(guān)鍵作用，可以誘導(dǎo)CD4+和CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生[38]。淋巴小結(jié)生發(fā)中心主要由B細(xì)胞和Th細(xì)胞組成，還多見(jiàn)濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本試驗(yàn)組織切片可見(jiàn)，與空白組和疫苗對(duì)照組相比，淋巴小結(jié)生發(fā)中心胸腺胸腺切片中PEP-H組胸腺小體數(shù)量增多，淋巴小結(jié)生發(fā)中心密度增加。

肝中含有大量免疫細(xì)胞，如枯否氏細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，彌散淋巴組織呈彌散性分布，與周?chē)M織無(wú)明顯分界，只含T細(xì)胞，有的也含較多的B細(xì)胞，此外還有少量的漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。相鄰肝細(xì)胞管之間的間隙為肝血竇，肝內(nèi)淋巴組織較豐富，在小葉間結(jié)締組織和肝小葉內(nèi)常見(jiàn)彌散淋巴組織。本試驗(yàn)肝組織切片可見(jiàn)與空白組和疫苗對(duì)照組相比，肝細(xì)胞排列更加緊密整齊呈條索狀，彌散淋巴組織和肝血竇增多，表明這些免疫器官的功能在PEP的作用下被激活。

以上結(jié)果表明，PEP可提高胸腺、脾、法氏囊和肝的器官指數(shù)，從而促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，與白靈菇多糖[39]和花粉多糖[40]對(duì)器官免疫指數(shù)的影響一致。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從余甘子中獲得糖含量較高且蛋白含量較低的PEP，由GlcA∶Glu∶Xyl∶Fuc組成(摩爾比為0.5∶8.3∶1.8∶0.3)，其表面呈片狀分布且含有多糖粒子。將PEP與ND疫苗配合使用后發(fā)現(xiàn)，PEP能提高雞NDV特異性抗體、INF-γ和IL-4的分泌水平，促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖，提高T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值和免疫器官指數(shù)，同時(shí)還能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育。PEP可作為免疫佐劑增強(qiáng)ND疫苗的免疫效果，為今后免疫佐劑的設(shè)計(jì)以及臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。