李 顯，張中旺，張富東，呂建亮，李嘉豪，潘 麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 OIE/中國(guó)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730064)

自Illum等[1]提出殼聚糖微粒作為鼻黏膜疫苗載體以來，其發(fā)展已有20多年。殼聚糖是由幾丁質(zhì)脫乙?；玫降囊环N天然的生物可降解聚合物(圖1)，具有無毒、黏附性好、生物利用度和電荷密度高等優(yōu)點(diǎn)，因而在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。與幾丁質(zhì)相比，殼聚糖有一個(gè)獨(dú)特的特點(diǎn)，即氨基葡萄糖殘基C-2位置存在伯胺[3-4]，大量氨基的存在不僅與其脫乙酰度密切相關(guān)，也為其改性提供了可能性。各種化學(xué)基團(tuán)的修飾決定了殼聚糖的功能和性質(zhì)，例如為了提高殼聚糖在疫苗遞送中的溶解性對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾，得到季銨化親水性衍生物三甲基殼聚糖[5-6]。對(duì)其進(jìn)行硫代化修飾，改性后的殼聚糖衍生物具有高滲透性、生物黏附性、高溶解度和原位凝膠性能[7]。此外，由于殼聚糖表面具有伯氨基的特性，也常用于接枝其他高分子化合物，如帶正電荷的殼聚糖包覆帶負(fù)電荷的PLGA，以提高對(duì)黏膜疫苗遞送的免疫應(yīng)答[8-9]。

圖1 幾丁質(zhì)脫乙?；玫綒ぞ厶荈ig.1 Deacetylation of chitin to produce chitosan

對(duì)于疫苗的遞送來說，還可利用殼聚糖表面官能團(tuán)容易修飾的特點(diǎn)，添加靶向抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)的化學(xué)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)靶向遞送。APCs(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)表面表達(dá)一系列病原體識(shí)別受體(PRRs)，包括Toll樣受體(TLRs)[10]和C型凝集素受體(CLRs)[11-12]。甘露糖受體(mannose receptor，MR)存在于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上，屬于CLRs家族成員。巨噬細(xì)胞表達(dá)的MR識(shí)別并內(nèi)吞以甘露糖基為末端的甘露糖基衍生物，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到早期的核內(nèi)體，核內(nèi)體中的抗原被定位于溶酶體，抗原片段被降解加工呈遞給MHC分子，刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13]。

在過去的幾年中，甘露糖基化的殼聚糖顆粒被用于不同抗原的遞呈中，并且取得了良好的預(yù)期效果[14-16]。但甘露糖基化的殼聚糖納米微球作為FMDV核酸疫苗遞呈載體卻鮮有報(bào)道。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前研究結(jié)果(未發(fā)表)，選擇A型口蹄疫病毒的代表性毒株FMDV/MM、FMDV/WH09和FMDV/AF72的若干抗原表位，分別為T細(xì)胞表位VP1(21-60aa)，B細(xì)胞表位VP1(140-160aa)、VP1(200-212 aa)，通過Linker(GGGGS)2進(jìn)行3種毒株表位的重復(fù)串聯(lián)得到FMDV TB表位的序列并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。因此，本研究以構(gòu)建的含有FMDV TB表位基因的真核表達(dá)質(zhì)粒為對(duì)象，對(duì)MCS-PLGA-NPs作為FMDV核酸疫苗遞送載體的特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為下一步該遞呈載體攜帶核酸靶向APCs表面甘露糖受體和應(yīng)用于動(dòng)物免疫的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞

真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP購(gòu)自淼靈生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒pUC57-TB-FL由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司優(yōu)化合成，RAW264.7細(xì)胞由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司(美國(guó))，DNA Marker DL5000(TaKaRa)購(gòu)自寶生物工程有限公司，工具酶HindⅢ、SalⅠ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司(美國(guó))，博來霉素、TAE電泳液購(gòu)自北京索萊寶公司，核酸染料購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，瓊脂糖購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，酵母提取物、胰化蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，低分子量殼聚糖、甘露糖、氰基硼氫化鈉、聚乙烯醇(PVA)均購(gòu)自Sigma公司，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA50：50，黏度0.29 dL·g-1)購(gòu)自山東省醫(yī)療器械研究所，無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，高糖DMEM basic培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DAPI染料、10×PBS、4%多聚甲醛組織細(xì)胞固定液均購(gòu)自索萊寶公司，DNase Ⅰ購(gòu)自日本TaKaRa公司，瓊脂糖購(gòu)自BIOWESTE公司(西班牙)，Cy3熒光素購(gòu)自Mirusbio公司，HRP標(biāo)記的兔源抗A型FMDV多克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，二氯甲烷、無水乙醇、冰醋酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋(DK-8D型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；立式電壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))；磁力攪拌器(84-1A型，上海司樂儀器有限公司)；水循環(huán)式真空泵(SHB-Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電子分析天平(Sartorius BAS124S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；電動(dòng)攪拌器(JJ-1型，常州國(guó)華電器有限公司)；低溫冷凍干燥儀(CSSS-4型，Gene Company Limi)元素分析儀(Elementar公司，德國(guó))；雙面超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；掃描電子顯微鏡(JSM-6701F)；粒徑測(cè)定儀(ZS90，美國(guó))；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))、凝膠/蛋白質(zhì)紫外成像系統(tǒng)(Bio-Rad ALD 1244型，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8，德國(guó)徠卡)。

1.4 真核過表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB的構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建合成的質(zhì)粒pUC57-TB-FL為模板質(zhì)粒，通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出目的基因TB。引物序列及酶切位點(diǎn)詳見表1。然后按照Z(yǔ)heng等[17]所述方法，將擴(kuò)增的TB基因通過HindⅢ和SalⅠ酶切位點(diǎn)插入連接到真核表達(dá)載體pBudCE4.1-EGFP上，構(gòu)建出含有綠色熒光蛋白基因的重組A/FMDV TB表位基因真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence used in the experiment

1.5 甘露糖基化殼聚糖的制備

采用甘露糖的醛基與殼聚糖分子表面氨基進(jìn)行西佛堿反應(yīng)，然后在氰基硼氫化鈉的還原作用下得到甘露糖修飾的殼聚糖衍生物(圖2)。制備方法參考Zhou等[18]所述，并在此基礎(chǔ)加以改進(jìn)。1)將 殼聚糖(500 mg，1倍量)加入30 mL甲醇∶超純水=1∶1的混合溶液中，此時(shí)殼聚糖呈粉末狀分散于混合溶液。加入溶液體積1%的醋酸后，溶液立刻變黏稠，狀態(tài)呈透明膠狀，若此時(shí)磁力攪拌器無法令其劇烈攪拌，將體系移至機(jī)械攪拌下。加入甘露糖(81 mg，0.15倍量)反應(yīng)過夜，約10 h。加入氰基硼氫化鈉(50 mg，0.45倍量)，此時(shí)體系出現(xiàn)大量氣泡浮于溶劑表面，強(qiáng)力攪拌使體系均勻反應(yīng)約6 h。反應(yīng)體系放大時(shí)按放大倍數(shù)增加藥品和溶劑的用量；2)后處理：向反應(yīng)體系中加入大量乙醇使產(chǎn)物分散，真空抽濾得到產(chǎn)物。將產(chǎn)物再溶于乙醇中分散約20 min，抽濾，重復(fù)3次，得到塊狀瓊脂樣產(chǎn)物。將產(chǎn)物溶于超純水中分散一次，抽濾得到的產(chǎn)物冷凍干燥，得到成品。將得到的成品取30 mg 50 ℃真空干燥過夜，用微量元素分析儀測(cè)定合成物中碳、氮、氫的元素含量，根據(jù)化學(xué)式計(jì)算甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的取代度(Z%)。燃燒法測(cè)定各元素占比。重復(fù)測(cè)量3次。

圖2 甘露糖基化殼聚糖合成線路Fig.2 Synthetic circuit diagram of mannylated chitosan

1.6 MCS-PLGA-NPs制備及表征

采用雙重乳化揮發(fā)法(W/O/W)制備MCS-PLGA-NPs，制備方法參考Zhou等[18]所述，并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。將1%的PLGA二氯甲烷溶液作為油相O，去離子水為水相W；二者混合冰浴超聲3 min，形成初乳W/O；再將初乳迅速倒入等體積0.5%甘露糖基化殼聚糖溶液和2%PVA溶液中，冰浴超聲5 min，形成復(fù)乳W/O/W；將復(fù)乳置于40 ℃水浴，磁力攪拌4 h揮發(fā)有機(jī)溶劑；4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，收集沉淀，去離子水洗滌2～3次，凍干后-20 ℃ 保存。將得到的MCS-PLGA-NPs重懸于去離子水中，用粒徑儀測(cè)定顆粒的粒徑、zeta電位；再將納米微球稀釋至合適濃度置于銅柱，自然干燥后噴金處理，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.7 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的測(cè)定

稱取適量納米微球至離心管中，與適量質(zhì)粒DNA(1 μg·μL-1)渦旋混勻，使納米微球的質(zhì)量與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比(w∶w)分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1，室溫孵育30 min。將各質(zhì)量比的樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察納米微球與質(zhì)粒DNA的結(jié)合情況。

1.8 MCS-PLGA-NPs結(jié)合質(zhì)粒DNA抵抗DNaseⅠ的降解

納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1進(jìn)行室溫孵育30 min。根據(jù)楊蘊(yùn)琦等[19]所述方法，按以下條件設(shè)置試驗(yàn)組：M組，裸質(zhì)粒DNA；1組，裸質(zhì)粒DNA+DNaseⅠ；2組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA；3組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA +0.5%SDS處理；4組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA+DNase Ⅰ處理后再用0.5%SDS處理組。然后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性的檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性。將RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；用DMEM將納米微球稀釋至濃度為100、80、60、40、20和10 μg·mL-1的混懸液，加至96孔板中，100 μL·孔-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每組重復(fù)6次，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入CCK-8,10 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%

A(加藥)：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；

A(0加藥)：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液孔的吸光度。

1.10 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物的攝取

采用激光共聚焦試驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞對(duì)MCS-PLGA-NPs-質(zhì)粒DNA復(fù)合物的攝取。質(zhì)粒DNA用熒光素Cy3標(biāo)記，然后將Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒與納米微球以60∶1的質(zhì)量比結(jié)合后，納米微球-DNA復(fù)合物與RAW264.7細(xì)胞共同孵育30 min，激光共聚焦觀察質(zhì)粒與納米微球的結(jié)合情況以及細(xì)胞對(duì)納米微球-DNA復(fù)合物的攝取情況。

1.11 MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7接種至12孔板，細(xì)胞密度約為5×105個(gè)·孔-1，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將MCS-PLGA-NPs與真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB按方法“1.7”中獲得的最適吸附效率結(jié)合與RAW264.7細(xì)胞共孵育，同時(shí)將空白細(xì)胞作為陰性對(duì)照。24 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫固定15 min，1×PBS溶液洗滌3次，每次5 min；加入300 μL DAPI溶液，室溫染色8 min，1×PBS溶液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。然后收取、處理表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞樣品，用抗FMDV的兔源特異性多克隆抗體對(duì)表達(dá)的重組TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05差異為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 含綠色熒光蛋白基因的重組A/FMDV TB表位基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)獲得的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，載體片段大約5 kb，目的基因片段大小約為597 bp，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。

1.重組質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB；2.重組質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB Hind Ⅲ和SalⅠ的雙酶切鑒定；M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.pBudCE4.1-EGFP-TB;2.pBudCE4.1-EGFP-TB digested with HindⅢ and SalⅠ;M.DL5000 DNA marker圖3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB的酶切鑒定Fig.3 The identification of plasmid pBudCE4.1-EGFP-TB by double enzyme digestion

2.2 甘露糖基化殼聚糖的獲得

假設(shè)殼聚糖的去乙酰度為X%，乙酰度為Y%，

則X%+Y%=1

(式1)

設(shè)此時(shí)殼聚糖的C元素(分子量12)與N元素(分子量14)的質(zhì)量比為A，去乙?；奶窃?個(gè)C原子，非去乙?；奶窃瓌t有8個(gè)C原子，則

A=(6*X%*12+8*Y%*12)/[14*(X%+Y%)]

(式2)

當(dāng)甘露糖修飾后，設(shè)C元素與N元素的質(zhì)量比為A’，取代值為Z%，去乙?；奶窃?個(gè)C原子，非去乙?；奶窃?個(gè)C原子，甘露糖修飾的糖原則有12個(gè)C原子，則

A’=[ 6*(X-Z)%*12+12*Z*12+8*Y%*12]/[14*((X-Z)%+Z%+Y%)]

(式3)

將式3化簡(jiǎn)得到取代值的計(jì)算式為

Z%=(14A’+24*X%-96)/72

(式4)

將元素分析測(cè)得的數(shù)值與殼聚糖去乙酰度代入(式4)即可計(jì)算出甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的取代值。得到4批甘露糖修飾的殼聚糖衍生物，取代值分別為10.60%、6.33%、6.72%和7.89%，見表2。

表2 元素分析測(cè)得的衍生物N、C、H的數(shù)值Table 2 Derivatives N,C,H values measured by elemental analysis

2.3 MCS-PLGA-NPs制備及表征

制備的納米微球在納米粒度儀下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其平均粒徑分布在255 nm，見圖4A，分散系數(shù)PDI為0.213，分散性良好，平均zeta電位為+19.9 mV，見圖4B，表明納米微球在水溶液狀態(tài)下具有結(jié)合帶負(fù)電荷質(zhì)粒DNA的能力。掃描電鏡下觀察，納米顆粒呈均一的球形，表面略微粗糙，粒徑大小為100～300 nm，與動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的粒徑分布一致，見圖5。

A.MCS-PLGA-NPs粒徑分布圖；B.MCS-PLGA-NPs zeta電位圖A.Size distribution of MCS-PLGA-NPs；B.Zeta potential of MCS-PLGA-NPs圖4 MCS-PLGA-NPs粒徑分布和zeta電位Fig.4 Size distribution and zeta potential of MCS-PLGA-NPs

圖5 MCS-PLGA-NPs掃描電鏡圖Fig.5 SEM of MCS-PLGA-NPs

2.4 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的測(cè)定

凝膠電泳結(jié)果顯示，MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒的能力隨其質(zhì)量的增加而增加。當(dāng)納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，質(zhì)粒DNA能完全結(jié)合在納米微球上，見圖6。因而，選擇納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳結(jié)合比。

M.質(zhì)粒DNA；1.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為20∶1；2.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為40∶1；3.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1；4.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為80∶1；5.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為100∶1M.Plasmid DNA;1:The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 20∶1；2.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 40∶1；3.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 60∶1；4.The mass ratio of nano-microspheres to plasmid DNA is 80∶1；5.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 100∶1圖6 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的凝膠電泳圖Fig.6 Gel electrophoresis of plasmid adsorption capacity of MCS-PLGA-NPs

2.5 MCS-PLGA-NPs結(jié)合質(zhì)粒DNA抵抗DNaseⅠ的降解能力

瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)表明，當(dāng)納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，通過靜電吸附的質(zhì)粒DNA完全結(jié)合在納米顆粒上(組2)。即使在電場(chǎng)條件下，帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA也很難從納米顆粒上解離下來，納米微球-DNA復(fù)合物完全被滯留在加樣孔中(組2)；納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA+SDS處理組表明，陰離子活性劑SDS能使質(zhì)粒DNA從納米微球上解離下來(組3)；納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA + DNase Ⅰ處理后再用SDS處理組表明，質(zhì)粒DNA結(jié)合在納米微球上可以在一定程度上抵抗DNase Ⅰ的降解(組4)。詳見圖7。

-.沒有；+.有；M.質(zhì)粒DNA；1.DNaseⅠ處理的質(zhì)粒DNA；2.MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物(w∶w=60∶1)；3.經(jīng) 0.5%SDS處理的納米微球-DNA復(fù)合物；4.DNaseⅠ處理過的納米微球-DNA復(fù)合物，再經(jīng)0.5%SDS處理后的上清-.Indicates no;+.Indicates yes;M.Plasmid DNA；1.Plasmid DNA digested with DNaseⅠ；2.MCS-PLGA-NPs-DNA complex (w∶w=60∶1)；3.Nanosphere-DNA complex treated with 0.5% SDS；4.The supernatant of nanosphere-DNA complex digested with DNaseⅠand then treated with 0.5% SDS圖7 MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物抵抗核酸酶降解的凝膠電泳圖Fig.7 Gel electrophoresis of MCS-PLGA-NPs-DNA complex resist degradation by DNase Ⅰ

2.6 MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性的檢測(cè)

CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μg·mL-1組與60 μg·mL-1組的MCS-PLGA-NPs與RAW264.7細(xì)胞孵育24 h后，對(duì)細(xì)胞存活率影響無明顯變化(P=0.121 2)。雖然100 μg·mL-1組與10 μg·mL-1組的納米微球?qū)?xì)胞存活率影響有顯著性差異(P<0.01)，但該組細(xì)胞存活率仍能達(dá)到85%以上，表明MCS-PLGA-NPs毒性較低。見圖8。

NS.無顯著差異；*.P<0.05；**.P<0.01NS.No significant difference；*.P<0.05；**.P<0.01圖8 MCS-PLGA-NPs的細(xì)胞毒性Fig.8 Cytotoxicity of MCS-PLGA-NPs

2.7 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物的攝取

質(zhì)粒DNA被熒光素Cy3標(biāo)記后，按照MCS-PLGA-NPs與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1進(jìn)行室溫結(jié)合30 min，然后與RAW264.7細(xì)胞共孵育30 min。激光共聚焦結(jié)果表明，Cy3熒光質(zhì)粒DNA成功吸附在MCS-PLGA-NPs表面并且小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7能很好地?cái)z取微球-質(zhì)粒DNA復(fù)合物。詳見圖9。

A.MCS-PLGA-NPs結(jié)合未被Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA激光共聚焦圖像；B.MCS-PLGA-NPs結(jié)合被Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA激光共聚焦圖像；DIC.明場(chǎng)；Cy3.經(jīng)Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA在綠色激光器下的狀態(tài)；DAPI.經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核；MERGE.DIC、Cy3、DAPI的疊加圖A.Confocal laser image of MCS-PLGA-NPs combined with plasmid DNA not labeled with Cy3；B.Confocal laser image of MCS-PLGA-NPs combined with plasmid DNA labeled with Cy3；DIC.Bright field；Cy3.The state of the Cy3-labeled plasmid DNA under the green laser；DAPI.DAPI-stained cell nucleus；MERGE.Overlay images of DIC,EGFP,and DAPI in three states圖9 RAW264.7細(xì)胞攝取MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物激光共聚焦圖像Fig.9 Confocal laser images of MCS-PLGA-NPs-DNA complex were captured by RAW264.7 cells

2.8 MCS-PLGA-NPS加載的質(zhì)粒DNA在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，綠色熒光蛋白正確表達(dá)，表明MCS-PLGA-NPs具有脂質(zhì)體類似的性質(zhì)，可以攜帶質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)。詳見圖10。為了進(jìn)一步確定重組蛋白TB的表達(dá)，用抗FMDV的兔源特異性多克隆抗體對(duì)TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，得到目的蛋白大小約22 ku，見圖11。結(jié)果表明，重組蛋白TB在RAW264.7中進(jìn)行了表達(dá)。

A.空白細(xì)胞熒光顯微鏡圖像；B.MCA-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物與細(xì)胞共孵育后24 h熒光顯微鏡圖像；DIC.明場(chǎng)；EGFP.表達(dá)的綠色熒光蛋白；DAPI.經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核；MERGE.DIC、EGFP、DAPI三種狀態(tài)下的疊加圖A.Fluorescence microscope image of blank cells；B.Fluorescence microscope image of MCA-PLGA-NPs-DNA complexes incubated with cells for 24 hours；DIC.Bright field；EGFP.Expressed green fluorescent protein；DAPI.DAPI stained cellular nucleus；MERGE.Overlay images of DIC,EGFP,and DAPI in three states圖10 MCS-PLGA-NPs吸附的DNA在細(xì)胞中的表達(dá)Fig.10 Expression of DNA adsorbed by MCS-PLGA-NPs in cells

1.陰性對(duì)照；2～4.TB蛋白1.Negative control；2-4.TB protein圖11 兔源FMDV多克隆抗體對(duì)TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定Fig.11 Identification of TB protein by Western blot with rabbit FMDV polyclonal antibody

3 討 論

核酸疫苗的低免疫原性一直是其應(yīng)用的主要限制，許多策略已經(jīng)被研究來提高疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效力[20]。陽(yáng)離子殼聚糖以其良好的生物性能被廣泛應(yīng)用于DNA[17,20-21]、RNA[22-24]的遞送。本試驗(yàn)利用陽(yáng)離子殼聚糖表面易被修飾的特點(diǎn)，將一定量的小分子甘露糖通過化學(xué)反應(yīng)連接到殼聚糖表面，模擬機(jī)體識(shí)別病原的模式，利用非病毒載體達(dá)到抗原的靶向遞送。研究發(fā)現(xiàn)甘露糖受體介導(dǎo)的抗原攝取與未經(jīng)甘露糖受體識(shí)別的抗原相比，將抗原遞呈到T細(xì)胞的效率提高了大約100倍[25]，這就意味著在短時(shí)間內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞可以攝取更多的抗原來激發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。最近的研究表明，殼聚糖納米顆粒還具有逃逸溶酶體的能力，使抗原免受溶酶體酸性環(huán)境的破壞[26]，抗原利用水平大幅提高。

殼聚糖表面較高的甘露糖修飾度，會(huì)使殼聚糖表面的伯氨基集團(tuán)減少，這導(dǎo)致殼聚糖納米微球難以制備和被細(xì)胞攝取[27]，甘露糖取代度在4%～21%不影響殼聚糖成球，并且能很好地發(fā)揮修飾后的免疫功能作用[28-30]。在本研究中，甘露糖的取代度在5%～10%,并且利用表面帶負(fù)電荷的PLGA作為陽(yáng)離子殼聚糖納米微球的內(nèi)核，更利于殼聚糖納米微球的形成。除此之外，帶負(fù)電荷的核酸吸附在殼聚糖的表面會(huì)占據(jù)一定的氨基，與甘露糖取代殼聚糖表面的伯氨基共同作用，減弱殼聚糖正電荷的性能?；谝陨峡紤]，選用低取代度的甘露糖基用以試驗(yàn)的驗(yàn)證研究。

本研究通過超聲乳化揮發(fā)的方法制備MCS-PLGA-NPs，然后將質(zhì)粒DNA通過靜電作用吸附在其表面。在先前的研究中，Zhao等[31]利用超聲乳化揮發(fā)的方法將新城疫病毒DNA疫苗作為水相包裹在殼聚糖PLGA納米微球的內(nèi)部，得到納米微球直徑為699.1 nm±5.2 nm，包封率為98.1%，zeta電位為+6.35 mV并且可以緩慢釋放包裹的DNA。Lebre等[20]在其研究中表明，質(zhì)粒DNA是以靜電吸附的方式結(jié)合在了殼聚糖納米微球的表面。事實(shí)上，質(zhì)粒DNA確實(shí)以靜電吸附的方式結(jié)合在殼聚糖納米微球的表面。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，這就使得殼聚糖本身含有大量的伯氨基。在水溶液狀態(tài)下，殼聚糖表面帶有大量的正電荷，即使殼聚糖包裹了水溶液狀態(tài)下帶有負(fù)電荷的PLGA，所制得納米微球的Zeta電位值仍然很高。Zhao等所制備的殼聚糖PLGA-DNA復(fù)合物zeta電位低的原因可能是除了包裹在納米微球內(nèi)部的DNA，還存在部分質(zhì)粒DNA吸附或包埋在納米微球的表面。在疫苗遞送中，殼聚糖納米微球的直徑越小越容易進(jìn)入細(xì)胞，從而提高核酸疫苗的遞送效率。采用Zhao等的方法(超聲功率50 W)得到的納米微球粒徑過大，雖然可以通過增大超聲功率來改變微球大小，但是，過大的超聲功率會(huì)大大損傷質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒250 W功率超聲1 min即可全部斷裂，結(jié)果未展示)。綜合以上考慮，本研究先制備粒徑較小的MCS-PLGA-NPs，然后再將質(zhì)粒DNA吸附其表面。

諸多文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖納米粒子吸附質(zhì)粒DNA后形成的殼聚糖-DNA復(fù)合物可以使DNA免受DNase I的降解[32-35]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，將其保護(hù)質(zhì)粒DNA免受DNase I的降解的原理解釋為：DNA與殼聚糖形成殼聚糖-DNA復(fù)合物時(shí)，DNA包裹在殼聚糖內(nèi)部和包埋在殼聚糖表面，使DNA免受DNase I損壞。而在本研究中，質(zhì)粒DNA不參與納米微球制備的過程，通過吸附在殼聚糖表面也能對(duì)質(zhì)粒DNA抵抗DNase I降解產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。對(duì)此現(xiàn)象的猜測(cè)：殼聚糖是一種帶有大量正電荷的二元線形聚合物，通過靜電力作用，DNA吸附在殼聚糖表面，類似鑲嵌，使DNA免受DNase I的降解。詳見圖12。

A.DNA包裹和包埋在殼聚糖粒子中；B.DNA鑲嵌在殼聚糖PLGA納米微球上A.DNA is wrapped and embedded in chitosan particles;B.DNA is embedded in chitosan PLGA nanospheres圖12 質(zhì)粒DNA免受DNase I的降解的原理Fig.12 Principle of protecting plasmid DNA from degradation by DNase I

殼聚糖作為一種非病毒基因傳遞系統(tǒng)受到研究人員的關(guān)注，但由于帶負(fù)電荷的DNA與帶正電荷殼聚糖之間存在較強(qiáng)的相互作用，其轉(zhuǎn)染效率較低[20]。這種低轉(zhuǎn)染效率又可以解釋為含有大量DNA的殼聚糖粒子在細(xì)胞表面附著不良、殼聚糖-DNA復(fù)合物無法逃逸溶酶體降解以及DNA從殼聚糖粒子中釋放不佳[20]。目前研究表明，載體和質(zhì)粒DNA之間平衡和適度的相互作用是成功轉(zhuǎn)染的因素之一，負(fù)電荷成分的加入可能有利于提高轉(zhuǎn)染效率[36-38]。海藻酸鹽[36]、聚谷氨酸[37-38]、人血清白蛋白[20]的加入降低了殼聚糖與DNA的相互作用強(qiáng)度，從而提高了轉(zhuǎn)染效率。本研究中，加入帶負(fù)電荷的PLGA作為殼聚糖納米微球的內(nèi)核與低甘露糖修飾共同作用可能也有助于提高殼聚糖遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率(未驗(yàn)證)?？傊髡叱晒χ苽淞薓CS-PLGA-NPs并利用其加載FMDV核酸疫苗在細(xì)胞中進(jìn)行成功表達(dá)，為FMDV核酸疫苗的遞送研究提供了新的方向和見解，也為該遞送載體攜帶特定抗原靶向APCs表面甘露糖受體以及應(yīng)用于動(dòng)物免疫的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

成功制備了MCS以及MCS-PLGA-NPs；明確了MCS-PLGA-NPs與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，吸附效果最好；MCS-PLGA-NPs加載FMDV核酸疫苗可以在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。本研究為后續(xù)FMDV核酸疫苗的遞送研究奠定了基礎(chǔ)。