焦智慧，馬亞軍，劉笑凝，張千振，王 月，劉 濤，樸晨曦，劉博洋，王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040)

肝是哺乳動物最大的實質(zhì)器官，具有加工儲存營養(yǎng)物質(zhì)、代謝藥物毒物、分泌膽汁、合成蛋白質(zhì)等重要功能。肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是外科手術(shù)常見的一種臨床綜合征[1]。20世紀(jì)90年代，出現(xiàn)腹腔鏡肝切除術(shù)，腹腔鏡技術(shù)可以減少腹壁神經(jīng)和肌肉的損傷，減少出血，加快術(shù)后恢復(fù)，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。盡管采用微創(chuàng)外科手術(shù)，在肝切除、肝移植等臨床手術(shù)中仍不可避免的出現(xiàn)HIRI，嚴(yán)重會導(dǎo)致肝炎、肝功能衰竭[3]。而炎癥反應(yīng)是HIRI重要的病理生理過程[4]，肝缺血再灌注后，引起炎性因子的釋放以及炎癥通路的激活，肝組織微循環(huán)紊亂造成細(xì)胞損傷，各種炎性因子的聚集導(dǎo)致血供受阻，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷甚至出現(xiàn)局部壞死。目前用于研究HIRI的實驗動物包括小鼠[5]、大鼠[6]、新西蘭大白兔[7]、犬[8]等，這些動物雖易于管理、重復(fù)性強，但動物體積、肝解剖結(jié)構(gòu)、新陳代謝和人相差很大，得到的研究結(jié)果應(yīng)用到人類也受到限制[9]，而小型豬與人的同源性相近，研究獲得的數(shù)據(jù)更有價值，在臨床上易于轉(zhuǎn)化，是研究HIRI較好的實驗動物選擇[10-11]。

近年來，隨著干細(xì)胞治療技術(shù)研究的深入，越來越多的研究支持干細(xì)胞旁分泌學(xué)說是干細(xì)胞療效的關(guān)鍵機制[12-13]。Lee等[14]首次描述了無細(xì)胞療法在臨床前動物模型中對肝疾病的應(yīng)用，也有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(mesenchymal stem cells condition medium,MSCs-CM)可以起到優(yōu)于干細(xì)胞本身的治療效果[15]。干細(xì)胞受微環(huán)境細(xì)胞和細(xì)胞分泌物的作用，分泌細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子進(jìn)入微環(huán)境中，并能招募其他干細(xì)胞，作用于受損的組織細(xì)胞[16]。目前，已有多項研究證明，干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在疾病治療方面的療效，包括心肌梗塞[17]、骨關(guān)節(jié)炎[18]、敗血癥[19]等。所以，本研究旨在通過建立小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除模型，探究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(adipose-derived mesenchymal stem cells condition medium,ADSC-CM)對肝缺血再灌注合并肝部分切除損傷炎癥反應(yīng)的作用，為比較醫(yī)學(xué)開展肝病治療，拓寬ADSC-CM移植領(lǐng)域提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

高清內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)、內(nèi)窺鏡冷光源(深圳市神州醫(yī)療設(shè)備有限公司)，全自動氣腹機、高頻智能電刀、腹腔鏡手術(shù)器械(日本Olympus公司)，動物呼吸麻醉機(美國SurgiVet公司)，血細(xì)胞分類計數(shù)儀(日本光電工業(yè))，酶標(biāo)儀(美國BIOTEK有限公司)，組織研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，qRT-PCR儀(瑞士Roche公司)。

硫酸阿托品注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司)，痛立定托芬那酸注射液(巍隆貿(mào)易有限公司)，丙泊酚乳狀注射液(西安力邦制藥有限公司)，異氟烷(河北一品制藥有限公司生產(chǎn))，DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Invitrogen有限公司)，胎牛血清(美國CLARK公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa生物技術(shù)有限公司)，熒光定量PCR染料(湖南Innovagene科技有限公司)，C反應(yīng)蛋白(CRP)、透明質(zhì)酸(HA)、皮質(zhì)醇(COR)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備

小型豬麻醉后于無菌條件下從腹部獲取脂肪組織，使用無菌的眼科剪將脂肪組織剪碎，加入Ⅰ型膠原酶充分消化后，使用含血清的培養(yǎng)基終止消化，用200目銅網(wǎng)過濾，濾液離心(1 500 r·min-1，10 min)后，棄去上清，用完全培養(yǎng)基(10% FBS，1%青鏈霉素，1%谷氨酰胺)重懸細(xì)胞并接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱(37 ℃，50 mL·L-1CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度生長至80%時傳代，細(xì)胞傳至第4代 進(jìn)行條件培養(yǎng)基的制備。棄去原培養(yǎng)基，無菌PBS清洗，換用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心(1 500 r·min-1，10 min)，將上清液用無菌濾器過濾，濾液用3 KD超濾管離心濃縮后，儲存在-80 ℃冰箱，供后續(xù)試驗使用。

1.3 實驗動物分組及手術(shù)處理

實驗動物為24頭廣西巴馬小型豬，4～6月齡，體重20～25 kg，飼養(yǎng)管理條件在整個試驗過程中保持一致，經(jīng)臨床整體和一般檢查、各系統(tǒng)檢查和實驗室血液常規(guī)檢查無異常后隨機分為4組：模型組(IRI)、DMEM對照組(DMEM)、ADSCs-CM治療組(CM)和ADSCs治療組(ADSCs)，每組6只。小型豬注射硫酸阿托品后，耳緣靜脈注射丙泊酚誘導(dǎo)麻醉，使用異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉，麻醉過程中，異氟烷濃度維持在2.5%～4.0%。4組均通過腹腔鏡技術(shù)建立小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除模型[20]，肝右葉持續(xù)缺血60 min后再灌注，然后使用高頻電刀離斷肝左葉，將注射的細(xì)針經(jīng)腹腔鏡套管口進(jìn)入，在距離肝斷端1～2 cm處，4組分別經(jīng)肝實質(zhì)注射不同的物質(zhì)，IRI組：生理鹽水，DMEM組：濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，CM組：濃縮的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，ADSCs組：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。其中，ADSCs使用劑量為1×106個細(xì)胞·kg-1，ADSCs-CM使用劑量為按照體重計算等量干細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基濃縮液，DMEM和生理鹽水的使用劑量與ADSCs-CM體積相同。術(shù)后肌內(nèi)注射痛立定，并將小型豬放在隔離圈舍單獨護(hù)理。試驗流程示意如圖1。

圖1 試驗流程圖Fig.1 Experimental process diagram

1.4 樣本采集與指標(biāo)檢測

1.4.1 樣本采集 樣本采集分為術(shù)前、術(shù)后1、3、7 d 4個時間點。血液樣本經(jīng)小型豬前腔靜脈采集，離心(3 000 r·min-1，10 min)后獲取血清；組織樣本通過腹腔鏡手術(shù)采集，樣本均保存在-80 ℃。

1.4.2 肝組織病理結(jié)構(gòu)觀察 將肝組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，按常規(guī)步驟進(jìn)行石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下讀片，觀察肝細(xì)胞是否存在變性、壞死，重點觀察炎性細(xì)胞浸潤的病理變化。

1.4.3 血液常規(guī)指標(biāo)檢測 使用血細(xì)胞計數(shù)儀對各組血液樣本進(jìn)行檢測，包括術(shù)前，術(shù)后1、3、7 d靜脈血中的白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NE)、淋巴細(xì)胞(LY)。

1.4.4 血清指標(biāo)ELISA檢測 檢測前從-80 ℃冰箱取出凍存的血清樣本，按照C反應(yīng)蛋白(CRP)、皮質(zhì)醇(COR)、透明質(zhì)酸(HA)試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀檢測各組不同時間點CRP、COR、HA的表達(dá)水平。

1.4.5 肝組織炎癥相關(guān)基因水平檢測 使用qRT-PCR檢測肝組織炎癥相關(guān)基因在各個時間點表達(dá)水平。用Trizol試劑提取總RNA，Prime ScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄。引物如表1所示。qRT-PCR反應(yīng)的體系：2 μL cDNA，0.8 μL上、下游引物，6.4 μL H2O和10 μL Taq SYBR?Green qPCR PreMix。使用Roche 480 qRT-PCR儀檢測，95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s重復(fù)40個循環(huán)，最后進(jìn)行融解反應(yīng)。根據(jù)2-ΔΔCt法計算炎癥相關(guān)基因IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA相對β-actin的表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR Primers sequences

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理結(jié)構(gòu)觀察

顯微鏡觀察各組切片，術(shù)后1、3 d病理變化明顯，出現(xiàn)較多炎性細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示：術(shù)后1 d，IRI組與DMEM組肝組織出現(xiàn)壞死灶，肝細(xì)胞索排列結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，而CM組與ADSCs組的肝細(xì)胞腫脹輕微，炎性細(xì)胞數(shù)量較IRI組與DMEM組少；術(shù)后3 d，IRI組與DMEM組仍可見較多的炎性細(xì)胞浸潤，而CM組與ADSCs組有少量的炎性細(xì)胞，細(xì)胞腫脹情況較IRI組與DMEM組輕微，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)。即肝缺血再灌注合并肝部分切除后，ADSCs與ADSCs-CM移植能減少炎性細(xì)胞的浸潤。

黃色箭頭表示炎性細(xì)胞；紅色箭頭表示壞死灶Yellow arrows indicate inflammatory cells;red arrows indicate necrotic foci圖2 肝組織病理變化(400×)Fig.2 Pathological changes of liver tissue(400×)

2.2 血液常規(guī)指標(biāo)

結(jié)果顯示，WBC、NE、LY在4組都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。圖3A為WBC結(jié)果分析：術(shù)后1 d，與IRI組相比，CM組極顯著(P<0.01)、ADSCs組顯著(0.010.05)，且DMEM組與IRI組、CM組與ADSCs組在各個時間點均無顯著性差異(P>0.05)，即CM組與ADSCs組可以降低血液中WBC、NE、LY的升高程度。

各時間點DMEM組、CM組、ADSCs組與IRI組比較，*.0.01

2.3 血清指標(biāo)ELISA檢測

肝缺血再灌注合并部分切除后，血清中CRP、COR、HA表達(dá)如圖4所示。術(shù)后1 d，與IRI組相比，CM組、ADSCs組均顯著降低了CRP、COR、HA的表達(dá)水平(P<0.01)，CM組與DMEM組具有統(tǒng)計學(xué)意義(CRP、HAP<0.01，COR 0.010.05)。DMEM組與IRI組、CM組與ADSCs組在各個時間點均無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 血清指標(biāo)檢測結(jié)果Fig.4 The results of serum parameters

2.4 肝組織炎癥指標(biāo)

肝組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平見圖5所示。圖5A為IL-6 mRNA表達(dá)水平：與IRI組相比，CM組和ADSCs組在術(shù)后1、3 d極顯著降低IL-6 mRNA水平(P<0.01)；術(shù)后1、3 d CM組與DMEM組差異極顯著(P<0.01)。圖5B為IL-1β mRNA表達(dá)水平：與IRI組相比，CM組和ADSCs組術(shù)后1 d極顯著(P<0.01)、3 d顯著(0.010.05)。即CM組與ADSCs組可以降低術(shù)后肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的升高程度，提高IL-10 mRNA的表達(dá)。

圖5 炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription levels of inflammation-related genes

3 討 論

肝缺血再灌注損傷涉及多種炎癥因子以及通路，是一個復(fù)雜的病理生理過程。肝缺血再灌注后，肝組織微循環(huán)紊亂，黏附在肝竇壁的WBC逐漸增多，WBC的聚集和活化導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷。缺血早期NE被激活，TNF-α能刺激NE的黏附并外滲，NE的聚集導(dǎo)致血供受阻，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷而致肝局部出現(xiàn)壞死灶。LY通過分泌IL-17促進(jìn)NE的遷移與黏附來激活補體系統(tǒng)[21]，同時分泌各種可溶性的細(xì)胞因子和化學(xué)因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。這也是肝缺血再灌注后通過病理切片能夠觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤以及局部壞死現(xiàn)象的原因。本研究結(jié)果顯示，ADSCs組和CM組減少了炎性細(xì)胞的浸潤并降低了WBC、NE、LY的表達(dá)，提示ADSCs和ADSC-CM均具有抗炎效果。研究表明，其他MSCs-CM對炎癥反應(yīng)有明顯的治療作用，Lee等[22]使用人的ADSCs-CM顯著改善了小鼠肝缺血再灌注損傷后的病理組織學(xué)評分；Kim等[23]使用扁桃體的MSCs-CM治療四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝損傷，結(jié)果證實其治療顯著減少了CCl4損傷小鼠肝的炎癥和肝組織病理損傷。

CRP是第一個被發(fā)現(xiàn)的機體急性期反應(yīng)蛋白，也是公認(rèn)的炎癥生物標(biāo)志物。肝缺血再灌注損傷后，肝細(xì)胞合成并分泌大量CRP，血液中CRP的濃度幾乎與組織損傷程度成正比，因此，能夠在血清中檢測到大量的CRP[24]。由于肝細(xì)胞損傷以及炎癥反應(yīng)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)神經(jīng)軸系(HPA)紊亂導(dǎo)致血清COR含量上升[25]。肝缺血再灌注會引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞可以通過HA的特異性受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用除去超過90%外周血中HA的含量[26]。因此，可以通過外周血中的HA水平衡量肝損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙[27]。在本研究中，肝缺血再灌注合并部分肝切除引起IRI組、DMEM組術(shù)后血清CRP、COR和HA含量迅速升高，而經(jīng)過ADSCs和ADSC-CM治療的兩組，有效減緩了CRP和COR的升高程度，抑制HA的升高。在Chen等[28]的研究中，MSCs-CM預(yù)處理明顯緩解肝照射后血清HA水平，與本研究結(jié)果一致。

肝缺血再灌注可引起各種炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)，如TNF-α、IL-1β、IL-6等。TNF-α不僅參與炎癥的反應(yīng)，還參與免疫應(yīng)答，過量的TNF-α還會和IL-1β激活肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而引起肝組織微循環(huán)障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死。微循環(huán)障礙又反過來誘導(dǎo)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)的釋放擴大了炎癥的效應(yīng)。因此，促炎因子IL-6在肝缺血再灌注的炎癥反應(yīng)中較TNF-α和IL-1β晚，但也促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。IL-10是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的能夠拮抗炎癥反應(yīng)的炎性介質(zhì)。在正常生理情況下，促炎因子與抑炎因子處于動態(tài)平衡，肝缺血再灌注后，引起大量促炎因子分泌激發(fā)過度炎癥反應(yīng)，抑炎因子IL-10含量隨之上升。IL-10能夠抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)，此外，還能增強其他抗炎性因子的釋放，如IL-1受體拮抗劑和溶解性TNF-α受體。已有研究表明，使用骨髓干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基治療體外輻射誘導(dǎo)大鼠的肝損傷模型，基因檢測結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)基給藥組顯著降低肝中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平，并增加IL-10 mRNA表達(dá)水平[28]。本研究顯示ADSCs組和CM組促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高程度受到抑制，而抑炎因子IL-10的升高程度被增強。本研究通過qRT-PCR方法對基因?qū)用孢M(jìn)行mRNA的檢測，基因從轉(zhuǎn)錄到翻譯還有復(fù)雜的過程，而ELISA檢測的是翻譯后的蛋白，對mRNA的檢測從炎癥早期證明，ADSC-CM能夠通過抑制促炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子的表達(dá)來減輕肝缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)。

本研究中，ADSCs與ADSC-CM作用效果沒有顯著差異，即在不移植干細(xì)胞的情況下，移植干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以起到等效的替代作用。目前，干細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，有研究表明，只有不到3%的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在移植后持續(xù)存活2周[29]，且移植后的干細(xì)胞仍然存在免疫排斥反應(yīng)[30]。而無細(xì)胞療法從源頭上避免干細(xì)胞移植的風(fēng)險，因此，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的研究與臨床應(yīng)用正逐漸開展。

4 結(jié) 論

本試驗探究了ADSCs和ADSC-CM對小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除炎癥反應(yīng)的療效，發(fā)現(xiàn)二者均能夠緩解缺血再灌注造成的病理學(xué)損傷，降低血液中炎性細(xì)胞數(shù)量及肝組織中促炎因子表達(dá)，并提高抑炎因子表達(dá)，緩解術(shù)后炎癥反應(yīng)。移植ADSC-CM對炎癥反應(yīng)的作用效果與ADSCs無顯著差異，因此，基于無細(xì)胞療法很可能成為未來干細(xì)胞移植的替代療法。