王永軍，周梅花，錢小飛，陳建良，王達(dá)飛

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)報(bào)道，2018年全球喉癌新發(fā)病例177 422例，死亡94 771例[2]。早期喉癌患者經(jīng)手術(shù)、放療和(或)化療后生存情況較好，但晚期患者預(yù)后仍較差[3-5]。因此，了解喉癌發(fā)生、進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)研究新的有效治療方法至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(circRNA)具有吸附微小RNA(miRNA)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接、翻譯蛋白、調(diào)節(jié)RNA-結(jié)合蛋白等生物學(xué)功能[6]。circRNA表達(dá)失調(diào)參與喉癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等惡性過程，在喉癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。有研究報(bào)道，宮頸癌中circ_0084927表達(dá)水平上調(diào)，沉默circ_0084927可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和黏附，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[9]。然而，circ_0084927在喉癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚。生物信息學(xué)分析顯示，miR-623是circ_0084927的潛在靶點(diǎn)。研究證實(shí)miR-623在胰腺癌、乳腺癌等多種實(shí)體惡性腫瘤中異常低表達(dá)，其過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞體內(nèi)外遷移及體外轉(zhuǎn)移過程[10-11]。敲減circ_0000144通過上調(diào)miR-623表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、谷氨酰胺代謝，加速細(xì)胞凋亡[12]。本研究探討circ_0084927靶向miR-623在喉癌進(jìn)展中的作用，旨在揭示喉癌進(jìn)展的可能機(jī)制，并為治療提供可用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1組織來源 收集2017年6月—2019年6月在我院接受手術(shù)治療的喉癌41例，取癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織(正常黏膜組織)，男38例，女3例，年齡51～72歲，中位年齡63歲；術(shù)前均未接受放化療或其他生物療法。所有患者或其家屬簽署知情同意書，本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞和試劑 人喉癌細(xì)胞TU177(上海弘順生物科技有限公司)；重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、anti-miR-NC、anti-miR-623購自廣州銳博生物公司；Omniscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒、miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、Trizol試劑、BCA蛋白分析試劑盒(武漢博士德生物公司)；膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒(上海銳賽生物公司)；剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)兔多克隆抗體(ab2302)、甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(ab9485)、羊抗兔IgG二抗(ab205718)、Cleaved-caspase3兔多克隆抗體(ab2324)購自上海艾博抗貿(mào)易公司。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR檢測(cè)circ_0084927和miR-623表達(dá)：用Trizol試劑從喉癌組織中提取總RNA，為檢測(cè)circ_0084927表達(dá)，使用Omniscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；為檢測(cè)miR-623表達(dá)，使用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBR Green PCR試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行RT-qPCR。U6、GAPDH分別為miR-623、circ_0084927的內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0084927和miR-623相對(duì)表達(dá)水平。circ_0084927上游引物5′-CTGGTGCAGCAAGATGGAAC-3′，下游引物5′-CTGCACCTCCCTTGGCAATA-3′；GAPDH上游引物5′-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3′，下游引物5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3′；miR-623上游引物5′-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組：TU177細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、濕度飽和、含5% CO2的培養(yǎng)箱孵育。1∶2～1∶3傳代。每周換液2～3次。將對(duì)數(shù)期TU177細(xì)胞接種于24孔板，密度為2×104個(gè)/孔，細(xì)胞50%融合時(shí)將si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-circ_0084927+anti-miR-NC、si-circ_0084927+anti-miR-623分別轉(zhuǎn)染TU177細(xì)胞，分為si-NC組、si-circ_0084927組、miR-NC組、miR-623組、pcDNA組、pcDNA-circ_0084927組、si-circ_0084927+anti-miR-NC組、si-circ_0084927+anti-miR-623組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)circ_0084927和(或)miR-623表達(dá)水平，隨后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：將各組TU177細(xì)胞接種于96孔板，密度為5×103個(gè)/孔，細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μl CCK-8溶液培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度(OD)值以表示細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:用含有5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶的100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸各組TU177細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106/ml。避光孵育15 min后，加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。取3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力:將各組TU177細(xì)胞接種于6孔板，密度為2×103個(gè)/孔，置于培養(yǎng)箱孵育2周直到出現(xiàn)細(xì)胞克隆，期間每3天換液1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞克隆15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，收集3次重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3.6Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá):用BCA蛋白分析試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，隨后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，隨后分別用一抗室溫孵育膜1 h，包括Cleaved-caspase3抗體、Cleaved-caspase9抗體、GAPDH抗體；然后用酶標(biāo)二抗室溫孵育膜2 h。應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以Image J軟件測(cè)得的目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)結(jié)果擴(kuò)增circ_0084927野生型(WT)和突變型(MUT)序列，并將其插入PGL4載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒WT-circ_0084927、MUT-circ_0084927。將miR-623 mimics、miR-NC分別與WT-circ_0084927或MUT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染TU177細(xì)胞，孵育48 h后用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性表示相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1circ_0084927和miR-623在喉癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，喉癌組織中circ_0084927相對(duì)表達(dá)水平升高，miR-623相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織和癌旁組織circ_0084927和miR-623的表達(dá)水平比較

2.2干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-circ_0084927組TU177細(xì)胞circ_0084927相對(duì)表達(dá)水平、OD值、克隆形成數(shù)降低,凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。見圖1和表2。

圖1 干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-623過表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與miR-NC組比較，miR-623組TU177細(xì)胞miR-623相對(duì)表達(dá)水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平升高，OD值及細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(P<0.01)。見圖2和表3。

圖2 miR-623過表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 miR-623過表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4circ_0084927靶向調(diào)控miR-623的表達(dá) Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)到circ_0084927與miR-623序列間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。miR-NC和WT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后TU177細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性為1.01±0.06，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后為0.48±0.05；與miR-NC和WT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染比較，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后TU177細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.01)。miR-NC和MUT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后TU177細(xì)胞熒光素酶活性為1.02±0.08，miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后為0.99±0.06；miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染后TU177細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性與miR-NC和MUT-circ_0084927共轉(zhuǎn)染比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-NC、si-circ_0084927組TU177細(xì)胞miR-623表達(dá)水平為1.00±0.00、0.35±0.04、0.98±0.06、3.07±0.24；pcDNA-circ_0084927組TU177細(xì)胞miR-623表達(dá)水平低于pcDNA組，si-circ_0084927組TU177細(xì)胞miR-623表達(dá)水平高于si-NC組(P<0.05)。

圖3 circ_0084927與miR-623序列中互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

2.5抑制miR-623表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與si-circ_0084927+anti-miR-NC組比較，si-circ_0084927+anti-miR-623組TU177細(xì)胞miR-623相對(duì)表達(dá)水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)升高(P<0.01)。見圖4和表4。

3 討論

circRNA在喉癌進(jìn)展中作用已被證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，circ_0067934高表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征顯著相關(guān)，circ_0067934高表達(dá)提示預(yù)后較差[13]。circRNA Ras相關(guān)序列家族2通過與miR-302b-3p相互作用并上調(diào)胰島素樣生長因子-1受體表達(dá)來促進(jìn)喉癌的進(jìn)展[14]。沉默circ_0042823對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及體內(nèi)腫瘤生長均有抑制作用[15]。

圖4 抑制miR-623表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞凋亡的作用

表4 抑制miR-623表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0084927表達(dá)對(duì)喉癌TU177細(xì)胞增殖和凋亡的作用

circ_0084927是一種高表達(dá)的circRNA，研究證實(shí)敲低circ_0084927基因可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[16]；敲除circ_0084927通過上調(diào)miR-142-3p表達(dá)還可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示，circ_0084927在喉癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，推測(cè)circ_0084927上調(diào)可能促進(jìn)了喉癌的進(jìn)展。功能分析顯示，轉(zhuǎn)染si-circ_0084927干擾circ_0084927表達(dá)可降低TU177細(xì)胞OD值和克隆能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；干擾circ_0084927表達(dá)后促凋亡因子Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達(dá)水平亦顯著升高。提示干擾circ_0084927表達(dá)可能通過激活caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果表明，circ_0084927在喉癌中具有癌基因樣作用，干擾circ_0084927表達(dá)通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡能夠抑制喉癌進(jìn)展。

circ_0084927在腫瘤進(jìn)展中的作用均與調(diào)控miRNA有關(guān)。研究指出，circ_0084927通過靶向下調(diào)miR-142-3p、miR-634誘導(dǎo)靶mRNA表達(dá)上調(diào)促進(jìn)宮頸癌惡性進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果證實(shí)，過表達(dá)circ_0084927可抑制miR-623表達(dá)，而干擾circ_0084927表達(dá)則促進(jìn)miR-623表達(dá)，且circ_0084927與miR-623存在直接相互作用，提示circ_0084927可靶向負(fù)性調(diào)控miR-623表達(dá)。有研究報(bào)道，miR-623靶向X線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因5可降低肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。miR-623靶向細(xì)胞周期蛋白D1基因可抑制胃癌細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其對(duì)5-氟尿嘧啶的化學(xué)敏感性[20]。此外，miR-623還可介導(dǎo)敲低長鏈非編碼RNA羧基末端結(jié)合蛋白1反義RNA2對(duì)肝癌進(jìn)展的抑制作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中miR-623表達(dá)降低，過表達(dá)miR-623可誘導(dǎo)TU177細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)，與干擾circ_0084927在喉癌中的抗腫瘤作用類似。為證實(shí)干擾circ_0084927表達(dá)的抗腫瘤作用依賴于miR-623表達(dá)水平升高，本研究將si-circ_0084927、anti-miR-623共轉(zhuǎn)染TU177細(xì)胞，結(jié)果顯示抑制miR-623表達(dá)可顯著減弱干擾circ_0084927對(duì)TU177細(xì)胞增殖和凋亡的影響，表明circ_0084927至少通過靶向下調(diào)miR-623參與喉癌進(jìn)展。

綜上所述，circ_0084927在喉癌中表達(dá)上調(diào)，干擾circ_0084927通過靶向上調(diào)miR-623表達(dá)可抑制喉癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。circ_0084927的作用機(jī)制與靶向負(fù)性調(diào)控miR-623表達(dá)有關(guān)。因此，靶向抑制circ_0084927/miR-623途徑可能是一種有效的喉癌治療策略。