肖婷婷,王 倩,雋加香,陳明杰,陳 輝,張津京,宋曉霞,黃建春

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心,國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,上海 201403)

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)屬草腐菌類食用菌,不僅味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,還具有很好的保健和藥用效果。 我國(guó)雙孢蘑菇工廠化栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大,促進(jìn)了產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展。 目前,江蘇裕灌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司、天水眾興菌業(yè)科技股份有限公司及上海聯(lián)中食用菌專業(yè)合作社等企業(yè)引進(jìn)了荷蘭雙孢蘑菇工廠化培養(yǎng)料三次發(fā)酵技術(shù),產(chǎn)量達(dá)到30 kg∕m2左右,一個(gè)生產(chǎn)周期約80 d,一年可栽培8—10 茬,實(shí)現(xiàn)了高度專業(yè)化、高效化、周年化生產(chǎn)[1]。 2020 年上海市雙孢蘑菇工廠化產(chǎn)量達(dá)到10 158 t,相比于2019年增加了58%,僅次于金針菇和真姬菇。

雙孢蘑菇三次發(fā)酵技術(shù)是將二次發(fā)酵制備的選擇性培養(yǎng)料混合雙孢蘑菇菌種后送入封閉式低壓隧道中,通過自動(dòng)控制空氣溫度、培養(yǎng)料溫度、氧氣濃度、風(fēng)速等參數(shù)進(jìn)行菌絲體的繁殖[2]。 在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)料損失大量能量,且隨著采摘潮次的增加培養(yǎng)料養(yǎng)分進(jìn)一步流失,極大限制了雙孢蘑菇的產(chǎn)量。 添加劑的使用能及時(shí)補(bǔ)充雙孢蘑菇生長(zhǎng)后期所需的養(yǎng)分,從而實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)的目的。 歐美國(guó)家雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)中,在播種或覆土階段添加輔料已比較普遍,并且已成為提高雙孢蘑菇產(chǎn)量的一個(gè)重要技術(shù)手段。添加的形式包括加入額外的蛋白質(zhì)、碳水化合物、油或者脂質(zhì)以及礦物質(zhì)和微量元素[3-6],如Mami 等[7]在雙孢蘑菇覆土中添加適量的圓整豆粒和玉米粒,提高了雙孢蘑菇的產(chǎn)量、子實(shí)體數(shù)量、干物質(zhì)含量、總可溶性固形物含量等。 我國(guó)雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)較少專注于添加劑的使用及其營(yíng)養(yǎng)成分的研究,雙孢蘑菇發(fā)菌料中添加劑的商業(yè)化產(chǎn)品也非常缺乏。

雙孢蘑菇的菌絲生長(zhǎng)速度直接影響到栽培周期的長(zhǎng)短,從而影響菇房的使用效率及工廠化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。 菌絲生物量的積累是雙孢蘑菇子實(shí)體形成和生長(zhǎng)的基礎(chǔ),探究雙孢蘑菇的營(yíng)養(yǎng)生殖特性,對(duì)提高雙孢蘑菇的產(chǎn)量具有積極意義。 醋酸鈉、檸檬酸鈉水解顯堿性,常用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類添加物。 前人研究發(fā)現(xiàn),在合成麥芽提取物培養(yǎng)基上添加0.1 g∕L 醋酸鈉可以增強(qiáng)雙孢蘑菇子實(shí)體的分化能力[8]。 此外,醋酸鈉、檸檬酸鈉還可以提高草菇菌絲生長(zhǎng)速度、生物量、產(chǎn)量及生物學(xué)效率[9]。 鑒于此,本研究采用一定濃度的醋酸鈉、檸檬酸鈉溶液處理雙孢蘑菇A15 菌株,探究雙孢蘑菇的菌絲生長(zhǎng)速度、生物量積累及產(chǎn)量的變化,以期將研究結(jié)果應(yīng)用到工廠化生產(chǎn)中,為雙孢蘑菇添加劑商品化產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢蘑菇A15 菌株的栽培種由美國(guó)施爾豐菌種公司提供。 雙孢蘑菇三次發(fā)酵料及覆土由上海聯(lián)中食用菌專業(yè)合作社提供。 醋酸鈉和檸檬酸鈉購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 PDA 培養(yǎng)基為常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

1.2 方法

雙孢蘑菇A15 菌株斜面活化后,接種于PDA 平皿上,25 ℃培養(yǎng)10 d,待菌絲長(zhǎng)滿平板后用于接種。將醋酸鈉、檸檬酸鈉作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn),PDA 培養(yǎng)測(cè)定雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度,液體培養(yǎng)測(cè)定菌絲生物量。 栽培試驗(yàn)地點(diǎn)為上海聯(lián)中食用菌專業(yè)合作社(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院雙孢蘑菇種植基地),分別在三次料和覆土后噴施不同濃度的醋酸鈉或檸檬酸鈉。

1.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

在 1 L 培養(yǎng)基中分別加入 0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、5.0 g 檸檬酸鈉粉末(或 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸鈉粉末),于121 ℃條件下滅菌20 min后倒入一次性平皿中備用。 選用同一生長(zhǎng)狀況的菌絲進(jìn)行接種,在長(zhǎng)滿菌絲的PDA 固體培養(yǎng)基上,取直徑為5 mm 的菌塊接種于不同濃度的醋酸鈉、檸檬酸鈉培養(yǎng)基上,置于25 ℃條件下暗培養(yǎng),用游標(biāo)卡尺測(cè)定10—13 d 菌落半徑,菌落半徑差值(mm)與生長(zhǎng)天數(shù)(d)比值即為菌絲生長(zhǎng)速度(mm∕d)。 每處理4 個(gè)重復(fù),以培養(yǎng)基中不添加任何試劑的處理為對(duì)照(CK)。

1.2.2 菌絲生物量測(cè)定

在 PDA 液體培養(yǎng)基中分別加入 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸鈉或檸檬酸鈉粉末,分裝于250 mL 錐形瓶?jī)?nèi),每瓶100 mL,每處理3 個(gè)重復(fù),以培養(yǎng)基中不添加任何試劑的處理為對(duì)照(CK)。 取活化后的A15 菌種菌落外圍1 cm 寬的菌絲塊放入均質(zhì)儀中,加入100 mL 無菌水,打碎10 s,取1 mL 菌液接入250 mL 錐形瓶中,150 r∕min、25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)17 d 時(shí),菌絲處于生長(zhǎng)旺盛階段,第17 天時(shí)收集菌絲。 用烘干至恒重(M1)的濾紙過濾,菌絲團(tuán)同濾紙共同烘干至恒重(M2),計(jì)算菌絲團(tuán)干重M= M2-M1。

1.2.3 栽培試驗(yàn)

1.2.3.1 噴施三次料處理

試驗(yàn)塑料栽培筐面積為 0.1 m2。 配制質(zhì)量濃度為 0.1 g∕L、0.5 g∕L、1.0 g∕L、1.5 g∕L、2.0 g∕L、2.5 g∕L的醋酸鈉和檸檬酸鈉溶液。 每筐稱取5 kg 三次發(fā)菌料,噴施50 mL 各處理溶液,將兩者充分混勻、壓實(shí),再將3.5 kg 東北泥炭土及50 g 三次發(fā)菌料攪拌均勻進(jìn)行覆土,隨機(jī)排列于菇房床架上,每處理4 個(gè)重復(fù)。以筐中不噴施任何溶液的處理為對(duì)照1,以噴施同樣量的清水處理為對(duì)照。 若對(duì)照1 與對(duì)照無顯著差異,表明雙孢蘑菇的發(fā)菌料經(jīng)溶液噴施對(duì)產(chǎn)量無顯著影響。 菌絲恢復(fù)階段通過控制菇房空氣溫度與回風(fēng)速率使料溫維持在25 ℃左右,CO2濃度在11.8 g∕m3以上,空氣濕度98%—100%,對(duì)培養(yǎng)料連續(xù)補(bǔ)水4—5 d 共計(jì)用量20—22 L∕m2。 進(jìn)料第7 天降溫并降低 CO2濃度,催蕾,出菇期間空氣溫度為17—18 ℃,濕度為83%—87%,CO2濃度2.4—2.9 g∕m3,風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為 50—60 次∕s。 第 20—24 天采摘第一潮菇,采摘后將床架表面殘留的菇腳清理干凈,對(duì)床架表面進(jìn)行補(bǔ)水,進(jìn)入轉(zhuǎn)潮期,7 d 后采摘第二潮菇,采摘后清理、補(bǔ)水,再次進(jìn)入轉(zhuǎn)潮期,7 d 后采摘第三潮菇,記錄各處理每潮菇的產(chǎn)量。

1.2.3.2 噴施覆土處理

菇房上料的同時(shí)進(jìn)行覆土。 配制質(zhì)量濃度為0.1 g∕L、1.0 g∕L 的醋酸鈉和檸檬酸鈉溶液。 每個(gè)處理選取1 m×1.35 m 的培養(yǎng)料床面,等分成4 個(gè)小區(qū),分別在打水期(3 次)、菇蕾期(1 次)、第一潮結(jié)束期(2 次)、第二潮結(jié)束期(2 次)共9 次對(duì)覆土表面噴施各處理溶液500 mL(用量需到達(dá)培養(yǎng)料層)。 以噴施同樣量的清水為對(duì)照。 雙孢蘑菇的降溫、催蕾、出菇和轉(zhuǎn)潮等菇房管理同1.2.3.1。 記錄各處理每潮菇的產(chǎn)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行Duncan 多重比較,P＜0.05 表示具有顯著差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)和生物量的影響

2.1.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

雙孢蘑菇A15 菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況見圖1,其中0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理的菌絲潔白粗壯、生長(zhǎng)快,菌落濃密。 如圖2 所示,不同質(zhì)量濃度檸檬酸鈉處理的雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度依次為0.5 g∕L ＞1.0 g∕L ＞1.5 g∕L ＞ CK ＞ 2.0 g∕L。 隨著檸檬酸鈉濃度的升高,菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 g∕L 時(shí),雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)受到了明顯抑制。 可見,培養(yǎng)基中添加適當(dāng)質(zhì)量濃度(0.5 g∕L)的檸檬酸鈉能夠促進(jìn)菌絲生長(zhǎng),濃度過高則會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度檸檬酸鈉培養(yǎng)基上雙孢蘑菇的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of A.bisporus on sodium citrate medium with different concentrations

圖2 不同濃度檸檬酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium citrate on mycelial growth rate of A.bisporus

如圖3—4 所示,0.1 g∕L 和0.2 g∕L 醋酸鈉處理的雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度快、分枝多且密,長(zhǎng)勢(shì)好。隨著醋酸鈉濃度繼續(xù)升高,菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 g∕L 時(shí),雙孢蘑菇生長(zhǎng)速度最慢。試驗(yàn)表明,0.2 g∕L 醋酸鈉處理能夠較好地促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)。

圖3 不同濃度醋酸鈉培養(yǎng)基上雙孢蘑菇的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of A.bisporus on sodium acetate medium with different concentrations

圖4 不同濃度醋酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of sodium acetate on mycelial growth rate of A.bisporus

2.1.2 對(duì)菌絲生物量的影響

如圖5 所示,當(dāng)檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g∕L 時(shí),雙孢蘑菇菌絲生物量最高,是CK 的2.6 倍,存在顯著差異。 當(dāng)醋酸鈉質(zhì)量濃度為0.1 g∕L 與0.5 g∕L 時(shí),雙孢蘑菇菌絲生物量最高,與CK 存在顯著差異,但達(dá)到 0.7 g∕L 時(shí),菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)了明顯的抑制現(xiàn)象。 綜上,0.2 g∕L 檸檬酸鈉、0.1 g∕L 和 0.5 g∕L 醋酸鈉處理可以提高雙孢蘑菇菌絲生物量的積累。

圖5 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲生物量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on mycelial biomass of A.bisporus

2.2 培養(yǎng)料中施用不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量影響

在上述檸檬酸鈉處理得到菌絲生長(zhǎng)最快質(zhì)量濃度(0.5 g∕L)、生物量最高質(zhì)量濃度(0.2 g∕L)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)檸檬酸鈉濃度的栽培試驗(yàn),即在雙孢蘑菇三次培養(yǎng)料中噴施不同濃度的檸檬酸鈉處理觀察產(chǎn)量變化。噴施清水與不噴施清水處理的產(chǎn)量無明顯差異,說明清水對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量不會(huì)造成影響(圖6—8)。 雙孢蘑菇三潮總產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)表明:0.5 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉處理的雙孢蘑菇產(chǎn)量高于CK,分別提高了12.7%、6.4%;其中0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理蘑菇產(chǎn)量最高,主要表現(xiàn)在第一潮及第三潮產(chǎn)量高于CK(圖8)。 醋酸鈉不同濃度栽培試驗(yàn)結(jié)果顯示,在雙孢蘑菇三次培養(yǎng)料中噴施不同濃度的醋酸鈉對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量無明顯影響(圖8),可能是雙孢蘑菇菌絲恢復(fù)階段補(bǔ)水過多,導(dǎo)致培養(yǎng)料積水腐爛,使D 處理產(chǎn)量降低。

圖6 不同濃度檸檬酸鈉噴施三次料的雙孢蘑菇出菇情況Fig.6 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate

圖8 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉噴施三次料對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of spraying three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on the yield of A.bisporus

圖7 不同濃度醋酸鈉噴施三次料的雙孢蘑菇出菇情況Fig.7 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium acetate

2.3 覆土上噴施高、低濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量影響

將鈉鹽進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用,培養(yǎng)料栽培面積從0.1 m2擴(kuò)大到1.35 m2,借鑒上述得到的鈉鹽促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量的最適濃度開展試驗(yàn)。 在雙孢蘑菇覆土后的表面噴施不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉溶液處理,觀察出菇情況(圖9)。 40 d 后統(tǒng)計(jì)雙孢蘑菇產(chǎn)量,結(jié)果表明:不同濃度的檸檬酸鈉處理均可提高雙孢蘑菇產(chǎn)量,且在第一潮較明顯;噴施0.1 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉使雙孢蘑菇產(chǎn)量分別提高了19.8%、21.6%(圖10)。 醋酸鈉處理結(jié)果顯示,0.1 g∕L 醋酸鈉處理使雙孢蘑菇產(chǎn)量提高了17.4%,主要提高了第一潮菇產(chǎn)量,而1.0 g∕L 醋酸鈉處理對(duì)產(chǎn)量無明顯影響。

圖9 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉噴施覆土的雙孢蘑菇出菇情況Fig.9 Fruiting situation of A.bisporus sprayed covering soil with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate

圖10 覆土后噴施不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of spraying different concentrations of sodium citrate and sodium acetate after covering soil on the yield of A.bisporus

3 結(jié)論與討論

本研究表明,在培養(yǎng)條件和接種條件一致的情況下,一定濃度的醋酸鈉或檸檬酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)量有較明顯的影響。 其中,0.1 g∕L 醋酸鈉處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)及生物量有促進(jìn)作用,覆土上噴施相同濃度溶液使雙孢蘑菇產(chǎn)量提高了17.4%,而培養(yǎng)料中噴施效果不明顯。 0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理可提高雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速度及生物量積累,噴施培養(yǎng)料使產(chǎn)量提高了12.7%;覆土后噴施0.1 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉使產(chǎn)量分別提高了 19.8% 、21.6% 。

侯立娟等[10]研究表明,0.7 g∕L 醋酸鈉或檸檬酸鈉處理可顯著增加草菇液體培養(yǎng)菌絲生物量,從而有助于提高草菇產(chǎn)量,原因可能是添加醋酸鈉后使培養(yǎng)基質(zhì)的pH 更有利于草菇菌絲的生長(zhǎng)。 本研究表明,隨著醋酸鈉或檸檬酸鈉處理濃度的升高,pH 會(huì)穩(wěn)定在一定范圍內(nèi),可能是醋酸鈉、檸檬酸鈉水解釋放堿性離子,起到了很好的緩沖作用,栽培生產(chǎn)中可避免因培養(yǎng)料pH 下降不利于蘑菇生長(zhǎng)的情況。

本研究中,0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理可以加快雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)速率、提高菌絲生物量,與林金盛等[9]研究結(jié)果相似。 吳風(fēng)雅等[11]研究表明,使用10 g∕L 醋酸溶液在雙孢蘑菇第三潮后每潮間期噴灑一次,有利于增補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)或促進(jìn)覆土中微生物系適度發(fā)展,進(jìn)而促進(jìn)雙孢蘑菇發(fā)育,可普遍增產(chǎn)10%左右。 本研究采用0.1 g∕L 醋酸鈉溶液在雙孢蘑菇覆土后每潮間期噴施,可增產(chǎn)17.4%,最適濃度產(chǎn)生差異的原因可能是醋酸鈉噴施的階段不同。 此外,Hou 等[12]在“噴重水期”(播種后5 d)用0.2 g∕L 醋酸鈉處理草菇栽培基質(zhì),有一定的增產(chǎn)效果,可能是草菇產(chǎn)生多種胞外酶,將大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐步降解為可溶并易于吸收利用的小分子糖類物質(zhì),為草菇營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、菌絲分化、原基形成提供養(yǎng)分。 本研究結(jié)果與之相似,同屬草腐菌的雙孢蘑菇覆土后噴施0.1 g∕L 醋酸鈉,產(chǎn)量提高了17.4%。

利用本研究得到的醋酸鈉、檸檬酸鈉溶液可以提高雙孢蘑菇產(chǎn)量的結(jié)果結(jié)合蘑菇生長(zhǎng)所需的碳源、氮源及微量元素等配制成添加劑產(chǎn)品,有助于解決工廠化生產(chǎn)中因培養(yǎng)料養(yǎng)分消耗限制蘑菇產(chǎn)量的問題。 醋酸鈉、檸檬酸鈉使草腐菌增產(chǎn)的原因可能是補(bǔ)充了微量元素,或提供了菌絲生長(zhǎng)利用的能量物質(zhì),亦或是增加了代謝通路中重要基因的表達(dá),如改變相關(guān)酶的調(diào)控活力等。 對(duì)于醋酸鈉、檸檬酸鈉提高雙孢蘑菇產(chǎn)量作用的分子機(jī)理及相關(guān)添加劑產(chǎn)品有待進(jìn)一步探究。