王 劍,徐慧明,門程芳,徐一凡,于瑞嵩,董世娟,謝春芳,李 震

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106)

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的一種高發(fā)病率、高死亡率的接觸性腸道傳染疾病[1-4]。 在我國(guó),由于常年保持較高的生豬存欄量,因此,豬群腹瀉病常年頻發(fā)。 其中,PEDV 的感染在我國(guó)豬群腹瀉病中占主導(dǎo)地位[5-9],造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 2010—2013 年,PED 在我國(guó)、亞洲其他國(guó)家和美國(guó)相繼大規(guī)模暴發(fā)[10-19]。 當(dāng)前,對(duì)該病進(jìn)行控制的有效手段只有通過(guò)免疫妊娠母豬,使初生仔豬通過(guò)母乳而獲得免疫,但母豬抗體水平與仔豬保護(hù)的相關(guān)性研究目前還比較缺乏,其中原因之一就是既沒(méi)有統(tǒng)一的攻毒模型,也沒(méi)有大家公認(rèn)的PEDV毒株用于建立攻毒模型。 半數(shù)致死量(Median Lethal Dose,LD50)原指在規(guī)定時(shí)間內(nèi),通過(guò)指定途徑,使一半受試動(dòng)物死亡的有害物質(zhì)、有毒物質(zhì)或游離輻射的最小劑量[20-22]。 LD50的單位常用受試物質(zhì)質(zhì)量與受試動(dòng)物質(zhì)量之比表示[23-24],比如mg∕kg 或copies∕mL。 LD50是評(píng)價(jià)藥物優(yōu)劣的重要參數(shù),是衡量藥物及一切與人類或動(dòng)物體接觸物質(zhì)的安全標(biāo)尺,對(duì)重復(fù)給藥試驗(yàn)的劑量設(shè)置和藥物臨床試驗(yàn)的起始劑量、最小有效劑量等指標(biāo)的選擇具有重要參考價(jià)值。 如今,LD50已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域,是新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[25-26],對(duì)后續(xù)新藥臨床試驗(yàn)至關(guān)重要。

豬流行性腹瀉是一種侵害初生仔豬重要豬病,呈世界流行[1-3]。 疫苗是該病的唯一防控辦法,但目前PEDV 疫苗研制仍困難重重,缺少穩(wěn)定可靠、可用于評(píng)估PED 疫苗的LD50攻毒模型是困難之一。 然而,國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有公開(kāi)發(fā)表與PEDV 有關(guān)的LD50試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 本研究對(duì)PEDV 腸毒株進(jìn)行鑒定并擴(kuò)增,利用qPCR對(duì)擴(kuò)增后的PEDV 進(jìn)行含量鑒定。 因目前未免疫PEDV 豬場(chǎng)很少,故采用人工飼喂,使用未吃初乳3 d 內(nèi)的新生仔豬。 受試動(dòng)物經(jīng)口服途徑攻毒,并對(duì)其采食量、體重、體溫等生理指標(biāo)進(jìn)行24 h、為期7 d 的觀察與記錄。 通過(guò)改進(jìn)寇氏法和Bliss 法計(jì)算PEDV-ZJXS12 LD50、LD0、LD100、i等。 本研究的方法及結(jié)果可為建立PEDV 新生仔豬的攻毒模型提供參考依據(jù),對(duì)其他冠狀病毒疫苗的攻毒模型同樣具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

PEDV 毒株:源自實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)哺乳期仔豬接種擴(kuò)增的流行性腸毒,后經(jīng)基因進(jìn)化樹(shù)、基因遺傳進(jìn)化和基因同源性分析[27]。 分析結(jié)果表明,該毒株為流行毒株,在本研究中命名為PEDV-XS12 毒株。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:PEDV-XS12 腸毒增殖的動(dòng)物購(gòu)自隆宇科技農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司試驗(yàn)用豬犬飼養(yǎng)中心,合格證編號(hào):201827470。 LD50試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自哈爾濱周邊地區(qū),體重(1.48 ±0.15)kg,公母各半,其父本均為‘杜洛克’,母本為‘大白’或‘長(zhǎng)白’。 上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為未吃初乳的PEDVAg-∕Ab-新生1 日齡健康仔豬。

1.2 PEDV-XS12 富集與定量

1.2.1 PEDV-XS12 富集

無(wú)菌環(huán)境下,小腸組織勻漿液經(jīng)0.9%氯化鈉注射用水稀釋至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織的病毒液,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

普通級(jí)環(huán)境下,對(duì)若干頭 PEDVAg-∕Ab-新生 1 日齡健康仔豬進(jìn)行人工預(yù)飼 1 d,隨后以 1 ×106copies∕mL、5 mL∕kg 病毒濃度經(jīng)口灌服仔豬(灌服前須停飼1 次)。 待仔豬進(jìn)入 PED 臨床明顯期初期,即食欲下降并出現(xiàn)首次腹瀉時(shí),立刻麻醉、剖殺,取小腸。 無(wú)菌環(huán)境下,將上述樣品勻漿并經(jīng)0.45 μm、0.22 μm 一次性濾器過(guò)濾,-80 ℃保存,待測(cè)。

1.2.2 病料PEDV RT-PCR 鑒定

通過(guò)檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因庫(kù)設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)分別對(duì) FMDV、TGEV、PCV2、CSFV、PPV、PRV、PDCoV、SSⅡ、PEDV 這 9 種病毒進(jìn)行鑒定,排除試驗(yàn)動(dòng)物被其他疾病感染、致死的可能性。

表1 豬傳染性疾病引物Table 1 The list of primers of swine infectious diseases for RT-PCR

1.2.3 PEDV-XS12 qPCR 定量

引物與探針設(shè)計(jì):利用MegAlign 軟件對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的多條PEDV-M 基因進(jìn)行同源性分析,Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)引物與熒光探針(表2),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PEDV-M陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品制備:首先,病毒勻漿液經(jīng)核酸提取、cDNA 制備及擴(kuò)增、1%凝膠電泳鑒定;其次,鑒定無(wú)誤后,分別將上述產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接與轉(zhuǎn)化(pMD?18-T Vector);最后,質(zhì)粒提取、定量,并將其換算成拷貝數(shù)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:對(duì)上述反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 樣品進(jìn)行10 倍稀釋,上機(jī)檢測(cè)。

表2 PEDV-M 基因引物針序列Table 2 The sequences of primers and probe for PEDV-M

1.3 PEDV-XS12 攻毒

LD50試驗(yàn)均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的嚴(yán)格指導(dǎo)下進(jìn)行操作,IACUC 編號(hào):HVRI-IACUC-2018-016。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SYXK(黑)-2017-009。

1.3.1 最小致死劑量與最大耐受劑量

普通級(jí)環(huán)境下,通過(guò)UDP、FDP 分別估算出最小致死劑量(Minimum Lethal Dose,LD100)、最大耐受劑量(Maximum Tolerable Dose,LD0)。

1.3.2 PEDV-XS12 LD50

分組:PEDV-XS12 LD100、PEDV-XS12 LD0實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為 10 頭∕組,其余各組為 8 頭∕組,共 6 組。 受試動(dòng)物采用人工飼喂,每次飼喂間隔3 h,預(yù)飼24 h,試驗(yàn)周期7 d。 飼養(yǎng)環(huán)境均為生物安全等級(jí)(Biological Safety Level,BSL)-3 級(jí),環(huán)境溫度30 ℃、濕度50%—60%、光照12 h 的屏障系統(tǒng)。

攻毒與臨床觀察:依據(jù)估算結(jié)果,對(duì)LD100和LD0的濃度做出預(yù)判,并計(jì)算出相鄰兩組劑量間的組距(Interval,i)、各組間濃度(表3)。 最終,以5 mL∕kg 病毒液經(jīng)口灌服仔豬(灌服前須停飼1 次)。 試驗(yàn)期間密切觀察仔豬臨床癥狀、記錄仔豬體溫、體重、采食量等各項(xiàng)體征指標(biāo)(表4)。

表3 LD50分組計(jì)算明細(xì)Table 3 The list of PEDV concentration and interval for LD50

表4 LD50體征指標(biāo)記錄Table 4 The list of pathological parameters for LD50 observation

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV-XS12 病料 RT-PCR 鑒定

通過(guò)RT-PCR 技術(shù),排除受試動(dòng)物臨床常見(jiàn)傳染疾病。 由圖1 可知,在擴(kuò)增的前8 種傳染病中,樣品的結(jié)果均為陰性。 根據(jù)PEDV 檢測(cè)結(jié)果顯示,其M基因片段大小為468 bp,樣品與陽(yáng)性對(duì)照條帶一致,水平位置略低于500 bp Marker,陰性對(duì)照無(wú)條帶。 因此,判斷該樣品只含有PEDV 流行毒株,即PEDV-XS12的核酸。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳篩選結(jié)果Fig.1 The result of 1% agarose gel electrophoresis

2.2 病料PEDV-XS12 qPCR 載量檢測(cè)

由圖2 可知,PEDV qPCR 斜率為-0.030,擴(kuò)增效率為113.8%。 用微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒OD260值,并通過(guò)質(zhì)粒濃度換算公式計(jì)算拷貝數(shù)(圖2、圖3)。

圖2 PEDV qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of PEDV qPCR

圖3 目的基因PEDV-M 擴(kuò)增曲線Fig.3 The result of amplification curve for PEDV-M gene

2.3 PEDV-XS12 LD50對(duì)仔豬體征的影響

2.3.1 PEDV-XS12 LD100對(duì)仔豬的影響

以200 copies∕mL、5 mL∕kg 的劑量對(duì)受試動(dòng)物口服攻毒,通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)受試動(dòng)物的采食量、體重、體溫、24 h 排泄量(糞和尿)、死亡頭數(shù),初步判斷PEDV-XS12 LD100濃度。 如圖4a 所示,口服攻毒1 d 與對(duì)照組相比,所有受試動(dòng)物采食人工乳量均大幅提高(P＜0.01),其中,有6 頭仔豬達(dá)到147.6 mL∕d。 24 h排泄量雖然也相應(yīng)升高(P＜0.01),達(dá)到80.9 mL∕d,但有5 頭低于該組的均值(圖4 d)。 攻毒2 d 與對(duì)照組相比,受試動(dòng)物的采食量均值雖仍維持在高水平(P＜0.01),但平均體重卻沒(méi)有增長(zhǎng),且平均24 h 排泄量和平均體溫分別出現(xiàn)增加和下降趨勢(shì)(P＜0.01),其中平均體溫為36.64 ℃,較對(duì)照組體溫下降1.2 ℃(圖4c—d)。 攻毒后3—7 d,受試動(dòng)物進(jìn)入感染的臨床明顯期,受試動(dòng)物的各體征指標(biāo)波動(dòng)較大,死亡頭數(shù)增加。 其中,隨著攻毒后時(shí)間的延續(xù),其平均采食量與平均24 h 排泄量呈負(fù)相關(guān),與平均體重和平均體溫趨勢(shì)分別呈正相關(guān)。

圖4 仔豬PEDV-XS12 LD100的體征指標(biāo)Fig.4 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD100 of PEDV-XS12

截至第6 天,所有受試動(dòng)物100%死亡,PEDV-XS12 LD50死亡時(shí)間為59—133.5 h,平均死亡時(shí)間為83 h。

2.3.2 PEDV-XS12 LD0對(duì)仔豬的影響

PEDV-XS12 LD100的合理濃度為 200 copies∕mL,本組別以上述濃度的 1∕10(20 copies∕mL)、5 mL∕kg 的劑量對(duì)受試動(dòng)物口服攻毒。 通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)受試動(dòng)物的采食量、體重、體溫、24 h 排泄量、死亡頭數(shù)體征指標(biāo),初步判斷PEDV-XS12 LD0濃度。 口服攻毒后1 d,平均體溫為38.7 ℃,較對(duì)照組升高0.6 ℃,而平均24 h 排泄量則與對(duì)照組持平(P＞0.05),并且數(shù)據(jù)離散度小于PEDV-XS12 LD100(圖5c—d)。 采食方面,該組平均采食量于攻毒后3 d 達(dá)到峰值(222.75 mL∕d)。 攻毒期間,受試動(dòng)物僅在攻毒后2—3 d 分別出現(xiàn)死亡。 由于多數(shù)受試動(dòng)物存活,因此平均24 h 排泄量在攻毒后7 d 達(dá)到峰值。

圖5 仔豬PEDV-XS12 LD0 的體征指標(biāo)Fig.5 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD0 of PEDV-XS12

截至試驗(yàn)結(jié)束,8 頭仔豬存活。 據(jù)此,PEDV-XS12 LD0死亡時(shí)間為48—72 h,平均死亡時(shí)間為56.75 h。

2.3.3 PEDV-XS12 LD80對(duì)仔豬的影響

依據(jù)PEDV-XS12 LD100和PEDV-XS12 LD0的濃度,并結(jié)合組別計(jì)算出平均i=0.63,得到PEDV-XS12 LD80的合理濃度為126 copies∕mL、5 mL∕kg 的劑量,進(jìn)一步判斷 PEDV-XS12 LD80濃度。 口服攻毒后1 d,受試動(dòng)物所有體征指標(biāo)均升高,平均體重和平均體溫直接達(dá)到峰值(圖6b—c)。 攻毒后2 d,受試動(dòng)物平均采食量達(dá)到峰值(120 mL∕d)。 至此,除平均24 h 排泄量以外,平均采食量、體重和體溫均呈下降趨勢(shì)(圖6d),其中平均體溫為37.9 ℃,較對(duì)照組下降0.6 ℃,較攻毒后1 d 平均體溫下降1.1 ℃。 通過(guò)與PEDVXS12 LD100相關(guān)體征指標(biāo)對(duì)比發(fā)現(xiàn),兩組的平均體重、體溫均在攻毒后1 d 達(dá)到峰值,此后二者均呈下降趨勢(shì)。 表明高濃度PEDV-XS12 的致病力可能與受試動(dòng)物的體重與體溫存在相關(guān)性。

圖6 仔豬PEDV-XS12 LD80的體征指標(biāo)Fig.6 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD80 of PEDV-XS12

截至試驗(yàn)結(jié)束,受試動(dòng)物死亡6 頭,PEDV-XS12 LD80死亡時(shí)間為96—120 h,平均死亡時(shí)間為118.2 h。

2.3.4 PEDV-XS12 LD60對(duì)仔豬的影響

通過(guò)i=0.63 所得出的PEDV-XS12 LD80死亡頭數(shù)少于PEDV-XS12 LD100。 因此,繼續(xù)通過(guò)相同的i算出 PEDV-XS12 LD60的合理濃度,即 79 copies∕mL、5 mL∕kg 的劑量,進(jìn)而判斷 PEDV-XS12 LD60的濃度。 口服攻毒后1 d,受試動(dòng)物平均采食量迅速增加(P＜0.01),達(dá)到160 mL∕d(圖7a),平均體重、體溫均達(dá)到峰值(圖7b—c),其中平均體溫為37.6 ℃。 隨后,受試動(dòng)物平均采食量不斷升高,并于攻毒后6 d 達(dá)到峰值(240 mL∕d)。

圖7 仔豬PEDV-XS12 LD60的體征指標(biāo)Fig.7 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD60 of PEDV-XS12

截至攻毒后7 d,共5 頭受試動(dòng)物死亡,PEDV-XS12 LD60死亡時(shí)間為33—106 h,平均死亡時(shí)間為60.1 h。

2.3.5 PEDV-XS12 LD40對(duì)仔豬的影響

通過(guò)i=0.63,計(jì)算出PEDV-XS12 LD40的合理濃度為50 copies∕mL、5 mL∕kg 的劑量,繼續(xù)對(duì)受試動(dòng)物口服攻毒,通過(guò)監(jiān)測(cè)受試動(dòng)物的采食量、體重、體溫、24 h 排泄量、死亡頭數(shù)體征指標(biāo),判斷PEDV-XS12 LD40的劑量。 受試動(dòng)物在口服攻毒前,各體征指標(biāo)正常。 口服攻毒1 d 時(shí),受試動(dòng)物的平均采食量顯著提高(160 mL∕d) (P＜0.01) (圖8a)。 受試動(dòng)物平均采食量在攻毒后 6 d 達(dá)到峰值(252 mL∕d),該指標(biāo)與平均24 h 排泄量的趨勢(shì)一致(呈正相關(guān)),與試驗(yàn)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(圖8a—d)。 與之相反,平均體重與體溫呈下降趨勢(shì),與試驗(yàn)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖8 仔豬PEDV-XS12 LD40的體征指標(biāo)Fig.8 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD40 of PEDV-XS12

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),受試動(dòng)物共死亡4 頭,攻毒后平均48 h 進(jìn)入臨床明顯期,PEDV-XS12 LD40死亡時(shí)間為42—130.5 h,平均死亡時(shí)間為73.1 h。2.3.6 PEDV-XS12 LD20對(duì)仔豬的影響

通過(guò)i=0.63,計(jì)算出 PEDV-XS12 LD20的合理濃度為31 copies∕mL、5 mL∕kg 的劑量。 對(duì)受試動(dòng)物口服攻毒,最后判斷PEDV-XS12 LD20的劑量。 攻毒48 h 內(nèi),受試動(dòng)物的平均采食量基本持平(P＞0.05),在攻毒3 d 時(shí)達(dá)到峰值(211.43 mL∕d) (圖9a—b)。 隨后 4 d,平均采食量保持在 200 mL∕d。 攻毒期間,該組平均體重、體溫趨勢(shì)保持一致,與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。 平均24 h 排泄量與其余各組趨勢(shì)基本一致,表明腹瀉的程度可能與感染后受試動(dòng)物的死亡時(shí)間有關(guān)。

圖9 仔豬PEDV-XS12 LD20的體征指標(biāo)Fig.9 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD20 of PEDV-XS12

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),共3 頭受試動(dòng)物死亡。

2.3.7 PEDV-XS12 LD50結(jié)果

各組受試動(dòng)物死亡率分別是:LD100=10∕10、LD80=6∕10、LD60=5∕10、LD40=4∕10、LD20=3∕10、LD0=2∕10。 采用改進(jìn)寇氏法和Bliss 法,將上述各組的死亡頭數(shù)、總頭數(shù)進(jìn)行回歸分析。 最終,得到PEDV-XS12 LD50為48.044 copies∕mL,95%置信區(qū)間為29.053—72.071,i=0.63。 該結(jié)果符合正態(tài)分布。

3 討論

PED 作為一種高發(fā)病率、高死亡率的接觸性腸道傳染疾病[4],對(duì)我國(guó)大陸地區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害。 對(duì)妊娠母豬進(jìn)行免疫,提高其泌乳期乳汁中特異性抗體的含量,增強(qiáng)哺乳仔豬被動(dòng)免疫效果,方可控制PED 疫情。 然而,因受技術(shù)原理以及研制過(guò)程等多方面影響,新疫苗效果是未知的,臨床應(yīng)用前需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)。 因當(dāng)前沒(méi)有PEDV 流行強(qiáng)毒株的LD50數(shù)據(jù),尚無(wú)通用的PEDV 攻毒模型,這給新疫苗研制和評(píng)價(jià)造成技術(shù)障礙。

為了填補(bǔ)該研究的空白,本研究選用父本為杜洛克,母本為長(zhǎng)白∕大白所繁育的3 d 未吃初乳的三元雜仔豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)口服途徑以5 mL∕kg 的PEDV-XS12 灌服,進(jìn)行LD50模型的測(cè)定。 目前,我國(guó)大部分豬場(chǎng)均存在PEDV 感染的現(xiàn)象,感染原因除與生豬養(yǎng)殖密度高、養(yǎng)殖技術(shù)欠發(fā)達(dá)等有關(guān)外,PEDV 在臨床上的致病力也是重要因素之一。 本試驗(yàn)結(jié)果表明,PEDV-XS12 只需要48 copies∕mL,5 mL∕kg 的劑量即可導(dǎo)致平均體重1.5 kg 的人工哺乳仔豬發(fā)病死亡過(guò)半,該結(jié)果間接反映出我國(guó)的PEDV 仍屬于強(qiáng)流行毒株的范疇,提示飼養(yǎng)人員應(yīng)全面加強(qiáng)母豬在妊娠后期的產(chǎn)房消毒工作。 腹瀉是PED 的主要臨床癥狀,在我國(guó)大陸地區(qū),PED 患病豬只除符合PEDV 感染特點(diǎn)外,其體內(nèi)往往含有其他腸道病毒,比如:TGEV、PDCoV 和PRV,形成符合感染。 因此,除平均排泄量指標(biāo)外,本研究還對(duì)受試動(dòng)物的平均采食量、體重、體溫等進(jìn)行24 h 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。 在平均排泄量方面,用一定劑量(LD40、LD20、LD0)的PEDV-XS12 感染受試動(dòng)物后,雖然試驗(yàn)周期內(nèi)的排泄量總體下降,每日排泄量增加趨勢(shì)緩慢,但不同劑量組間的平均排泄量卻沒(méi)有相關(guān)性,說(shuō)明僅憑腹瀉量單個(gè)指標(biāo)并不能準(zhǔn)確反映出患病豬只的感染程度和預(yù)后。 在臨床中,采食量是飼養(yǎng)人員評(píng)判動(dòng)物生理機(jī)能是否健康的主要標(biāo)準(zhǔn)之一,在發(fā)現(xiàn)動(dòng)物采食量下降時(shí),其疾病早已進(jìn)入臨床明顯期,這對(duì)預(yù)防 PED 極為不利。 受試動(dòng)物感染 PEDV-XS12 期間,采食量(LD80、LD60、LD40、LD20、LD0)遠(yuǎn)高于對(duì)照組,除了排泄量以外,其他指標(biāo)均與PEDV-XS12 載量和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。 由于PEDV-XS12 主要侵襲小腸部位,受試動(dòng)物仍有食欲,因此采食量與排泄量呈正相關(guān)。 本研究根據(jù)臨床觀察發(fā)現(xiàn),體溫是判斷受試動(dòng)物是否感染PEDV-XS12 的主要指標(biāo),再結(jié)合體重與糞便形態(tài)指標(biāo),可以準(zhǔn)確判斷出感染階段是前驅(qū)期還是臨床明顯期,這對(duì)仔豬感染PED 后的臨床判斷具有重要的指導(dǎo)作用。

研究者從不同角度對(duì)LD50的測(cè)算方法進(jìn)行設(shè)計(jì)與改進(jìn),截至目前,針對(duì)不同受試物質(zhì)和受試對(duì)象,LD50的測(cè)算方法多達(dá)十幾種[26,28-31]。 LD50的計(jì)算方法分為兩類:一類是傳統(tǒng)方法,比如霍恩氏法、寇氏法、改進(jìn)寇氏法、Bliss 法等;另一類則是改進(jìn)方法,比如UDP、FDP 等[32-33]。 盡管LD50測(cè)算方法經(jīng)過(guò)幾十年研究已有許多重要進(jìn)展,但目前還無(wú)法提出一種任何條件下都能令人滿意的方法。 因此,本研究首先采用UDP 對(duì)PEDV-XS12 LD100進(jìn)行估算。 UDP 又被稱為序貫法,是由Dixon 和Mood 于1948 年首次提出,后經(jīng)Bruce 利用優(yōu)選法對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)[34],即以受試動(dòng)物死亡為目的,用最少的受試動(dòng)物測(cè)算出LD100。 本試驗(yàn)首先針對(duì)受試動(dòng)物隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)劑量點(diǎn),每次只攻毒1 頭仔豬。 然后,根據(jù)攻毒后仔豬的反應(yīng)決定下一個(gè)攻毒劑量。 若仔豬存活,攻毒劑量則提高,若仔豬出現(xiàn)死亡或?yàn)l死,攻毒劑量則降低。 最后,逐漸縮小病毒濃度范圍,進(jìn)行正式試驗(yàn)的驗(yàn)證。 在測(cè)算PEDV-XS12 LD0時(shí),本研究采用FDP。 FDP 是1984 年由英國(guó)毒理協(xié)會(huì)提出的[35],與UDP 不同的是,該方法設(shè)有固定劑量和多個(gè)組別,并且不以受試動(dòng)物死亡為目的,而是以攻毒后受試動(dòng)物的毒性癥狀來(lái)判斷受試物質(zhì)的毒力。 FDP 分為預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)兩部分。本研究在預(yù)試驗(yàn)中,對(duì)PEDV-XS12 LD100病毒原液進(jìn)行倍比稀釋,各劑量組別分別攻毒1 頭仔豬,并觀察攻毒后仔豬發(fā)病癥狀,用以篩選出既有毒性又不死亡的候選劑量。 正式試驗(yàn)則用候選劑量對(duì)仔豬攻毒,每個(gè)候選劑量組有4 頭仔豬,攻毒后7 d 內(nèi)無(wú)仔豬死亡的劑量即為PEDV-XS12 LD0。

為了求出PEDV-XS12 對(duì)仔豬的 LD50,對(duì)其設(shè)置了4 個(gè)濃度組,并通過(guò) PEDV-XS12 LD100和 PEDVXS12 LD0的病毒載量計(jì)算出i,即兩組病毒載量之間的比值,并根據(jù)i調(diào)整各組攻毒劑量。 在分組方面,采用了改進(jìn)寇氏法,即在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中同時(shí)滿足以下四種條件:最低劑量組的反應(yīng)率≤20%,最高劑量組≥80%;反應(yīng)率大致呈正態(tài)分布;劑量必須按等比級(jí)數(shù)分布;各組受試動(dòng)物數(shù)量相等[36]。 最后,通過(guò)Bliss 法對(duì)攻毒7 d 后,各組仔豬總頭數(shù)、仔豬存活頭數(shù)和死亡頭數(shù)進(jìn)行回歸分析,得到最終的PEDV-XS12 LD50為48.044 copies∕mL。 Bliss 法又稱加權(quán)幾率單位法,利用對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)率的轉(zhuǎn)換數(shù)呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì),通過(guò)對(duì)幾率單位期望值的反復(fù)校正及加權(quán)處理,求出回歸直線方程。 在眾多LD50計(jì)算方法中,該方法最為精確、可靠,可以獲得LD5—LD95全部參數(shù)[37-41];同時(shí),該方法也是新藥審批辦法中所推薦使用的。