譚 云， 申愛(ài)榮， 譚著明， 沈?qū)毭?/p>

(1.湖南省菌根性食用菌種質(zhì)資源保護(hù)與利用中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 3.湖南省林下特色生物資源培育與利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

紅汁乳菇(Lactariuslividatus)隸屬于擔(dān)子菌門、紅菇科、乳菇屬，俗稱寒菌、雁鵝菌、樅菌、銅鑼菌、紫花菌、絲茅菌等[1]。其子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，食用、藥用價(jià)值高， 富含真菌多糖、粗纖維、不飽和脂肪酸、核酸衍生物、多種氨基酸及維生素等生物活性成份[2]，具有益腸胃、抗癌等藥用功效，是一種天然優(yōu)質(zhì)多功能菌物食品。紅汁乳菇在我國(guó)及日本、韓國(guó)、泰國(guó)等地有著悠久的食用歷史和廣闊的市場(chǎng)，并已發(fā)展成為野生食用菌市場(chǎng)的大宗產(chǎn)品。該菌可鮮食、速凍或加工成菌油，產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)、市場(chǎng)容量大，是一種開(kāi)發(fā)前景廣闊的菌根性食用菌。國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)對(duì)紅汁乳菇的研究已持續(xù)多年，涉及其生理生化特征、菌種培養(yǎng)、菌根合成、營(yíng)養(yǎng)成分、功能成分分析等。21世紀(jì)初，通過(guò)人工接種、培育紅汁乳菇菌根苗，建立菌根性食用菌種植園，并收獲子實(shí)體的技術(shù)路線和方案首度取得成功[3]。此后，紅汁乳菇逐漸成為野生菌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。隨著菌根性食用菌種植園建設(shè)逐步興起，滿足市場(chǎng)對(duì)菌根苗質(zhì)量的更高要求成為研究者追求的新目標(biāo)。在紅汁乳菇菌根苗培育過(guò)程中，優(yōu)良菌種是提高菌根苗質(zhì)量和子實(shí)體產(chǎn)量的關(guān)鍵。其中，菌種繁殖、菌劑制備則是重要的工藝問(wèn)題。菌劑制備環(huán)節(jié)相對(duì)耗時(shí)，主要原因是紅汁乳菇離體菌絲普遍存在生長(zhǎng)速度慢，并伴有自溶現(xiàn)象。此外，菌種自身活力、生長(zhǎng)速度等生理特性會(huì)直接影響菌種增殖。因此，縮短培養(yǎng)周期、提高菌種活力是紅汁乳菇菌種繁殖必須優(yōu)先解決的難題。紅汁乳菇菌劑生產(chǎn)一般經(jīng)過(guò)固體平板培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)兩個(gè)階段，在此過(guò)程中，培養(yǎng)基成分與配比對(duì)菌種的菌絲體增殖速度影響最直接。因此，除優(yōu)良菌種外，篩選合適的培養(yǎng)基也是解決上述難題的前提之一。關(guān)于紅汁乳菇培養(yǎng)基的研究，已有很多報(bào)道[4-11]，但研究結(jié)論各不相同，沒(méi)有普遍認(rèn)可的配方，以致參考者莫衷一是。為此，我們比較、篩選和驗(yàn)證了多種培養(yǎng)基配方，以期獲得符合菌根苗高效培育目標(biāo)的紅汁乳菇培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)用菌株分離于湖南嘉禾縣試驗(yàn)基地的野生紅汁乳菇子實(shí)體。菌株經(jīng)過(guò)ITS測(cè)序，與紅汁乳菇子實(shí)體ITS序列一致。12種菌株分別命名為C2、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH7、JH8、JH10、JH11、JH12、JH13。選擇其中生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)勢(shì)好、不易老化自溶、侵染能力強(qiáng)的菌株C2用于培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，其余用于菌株與培養(yǎng)基的匹配試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 將已報(bào)道不同配方的培養(yǎng)基分為4組，第一組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第二組為優(yōu)化后的紅汁乳菇固體或液體培養(yǎng)基，第三組為以PDA為基礎(chǔ)的微調(diào)培養(yǎng)基，第四組為廣泛采用的菌根真菌培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基的配方及來(lái)源(參考文獻(xiàn))見(jiàn)表1至表4,所有培養(yǎng)基的pH值均為5.5～6.5。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Tab.1 The basic mediumg·L-1培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基配方配方參考文獻(xiàn)W1葡萄糖20.00、蛋白胨2.00、磷酸二氫鉀2.00、七水硫酸鎂1.00[4]W2葡萄糖10.00、蔗糖10.00、蛋白胨2.00、磷酸二氫鉀2.00、七水硫酸鎂1.00[4]W3葡萄糖10.00、蔗糖10.00、酵母膏2.00,磷酸二氫鉀2.00、七水硫酸鎂1.00[4]W4葡萄糖20.00、蛋白胨2.00、磷酸二氫鉀1.00、七水硫酸鎂0.50[12]W5葡萄糖20.00、硝酸鈣4.00、磷酸二氫鉀0.50、七水硫酸鎂0.50[5]W6葡萄糖20.00、蛋白胨6.00、磷酸二氫鉀0.50、七水硫酸鎂0.50[5]W7蔗糖10.00、蛋白胨1.50、磷酸二氫鉀 1.00、硫酸銨1.00、七水硫酸鎂 0.50[6]

表2 優(yōu)化培養(yǎng)基Tab.2 The optimized mediumg·L-1培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基配方配方參考文獻(xiàn)W14果糖20.00、蛋白胨2.00、磷酸二氫鉀2.00、七水硫酸鎂1.00、磷酸氫二鉀0.50[4]W15葡萄糖48.30、麥芽糖45.29、蛋白胨4.69、酵母膏4.12、磷酸二氫鉀1.00、七水硫酸鎂 0.50[12]W16果糖30.253、蛋白胨3.576、磷酸二氫鉀2.50[13]W17糊精25.00、牛肉膏20.00、蔗糖20.00、甘露醇10.00、七水硫酸鎂0.10、激動(dòng)素10.00、煙酸5.00、核黃素1.00[7]W18麥芽糖40.09、蛋白胨3.35、磷酸二氫鉀1.98[14]W19磷酸氫二氨0.25、磷酸二氫鉀0.50、七水硫酸鎂0.15、氯化鈣0.05、氯化鈉2.50×10-2、乙二胺四乙酸鐵銨0.02、維生素B1 1.00×10-6,葡萄糖15.00,麥芽浸膏3.00[8]

表3 以PDA為基礎(chǔ)的微調(diào)培養(yǎng)基Tab.3 The PDA based mediumg·L-1培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基配方配方參考文獻(xiàn)W22馬鈴薯200.00、蔗糖20.00、磷酸二氫鉀3.00、七水硫酸鎂 1.00[15]W23馬鈴薯200.00、葡萄糖10.00、蔗糖10.00、蛋白胨2.00、磷酸二氫鉀1.00、七水硫酸鎂 0.50[12]W24馬鈴薯200.00、蔗糖20.00、磷酸二氫鉀1.50、七水硫酸鎂0.50、維生素B1 0.05[9]W25馬鈴薯200.00、葡萄糖20.00、磷酸二氫鉀3.00、七水硫酸鎂1.50[8]W27馬鈴薯200.00、葡萄糖20.00、麥芽汁(12Be°)500、維生素B1 0.05[16]PDA馬鈴薯200.00、葡萄糖20.00 注: 麥芽汁單位為mL,下同。

表4 廣泛采用的菌根菌培養(yǎng)基Tab.4 The widely used mycorrhizal mediumg·L-1培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基配方配方參考文獻(xiàn)YpSs磷酸二氫鉀 1.00、七水硫酸鎂0.50、酵母浸膏4.00、可溶性淀粉15.00[17]WPM硝酸銨0.40、硫酸鉀0.99、磷酸二氫鉀0.17、七水硫酸鎂0.37、硫酸鋅8.60×10-3、硫酸亞鐵2.78×10-2、肌醇0.10、煙酸0.50×10-3、甘氨酸0.2×10-3、硝酸鈣5.56×10-1 、氯化鈣9.60×10-2、鉬酸鈉2.50×10-4、硫酸錳2.24×10-2、硫酸銅2.50×10-4、乙二胺四乙酸3.73×10-2、維生素B11.00×10-4、維生素B6 5.00×10-4、蔗糖20.00[18] MMN氯化鈣0.05、磷酸二氫鉀0.50、氯化鈉2.50×10-2、磷酸二氫銨0.25、七水硫酸鎂0.15、三氯化鐵(1%)12.00、維生素B11.00×10-4、葡萄糖15.00、麥芽汁(12Be°)100.00、檸檬酸0.20[19]改良MMN氯化鈣0.05、磷酸二氫鉀0.50、氯化鈉2.50×10-2、磷酸二氫銨0.25、七水硫酸鎂0.15、三氯化鐵1.20×10-2、維生素B11.00×10-3、葡萄糖10.00、麥芽糖3.00、酵母提取物1.00[20]HM磷酸二氫鉀0.50、七水硫酸鎂0.50、氯化銨0.50、三氯化鐵(1%) 0.50、葡萄糖5.00、麥芽浸膏5.00、維生素B15.00×10-5、金霉素3.50×10-2[21]YMT磷酸二氫鉀1.00、七水硫酸鎂0.50、葡萄糖20.00、麥芽浸膏5.00、酵母浸膏2.00、維生素B11.00×10-4、金霉素3.50×10-2[17]PACH酒石酸銨0.50、七水硫酸鎂0.50、麥芽糖5.00、KH2PO4磷酸二氫鉀1.00、維生素B1 0.10、葡萄糖20.00、硼酸8.45、硫酸錳5.00×10-3 、鉬酸鈉3.00×10-4 、硫酸亞鐵6.00×10-3、硫酸銅6.30×10-4、硫酸鋅2.27×10-3[16]BAF氯化鈣0.10、磷酸二氫鉀0.50、七水硫酸鎂0.50、硫酸錳5.00×10-2 、硫酸鋅1.10×10-2 、三氯化鐵0.01、肌醇5.00×10-5、葉酸1.00×10-4 、維生素B15.00×10-5、葡萄糖30.00、酵母提取物0.20、蛋白胨2.00[22]注: 三氯化鐵(1%)單位為mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備 配制PDA固體培養(yǎng)基，活化C2斜面菌種，(24±1)℃條件下黑暗培養(yǎng)，待生長(zhǎng)旺盛、致密的菌絲長(zhǎng)滿1/2平板后，備用。

1.2.2 生長(zhǎng)速度測(cè)定 在無(wú)菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器在菌種平板上打孔，接種到上述各不同固體培養(yǎng)基中，每種配方接種3皿，各重復(fù)3次，用封口膜封口，(24±1)℃下黑暗培養(yǎng)，隨時(shí)觀察菌絲密度、顏色變化，每7 d采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑。按公式(1)計(jì)算紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)速度。

(1)

式中：V為菌絲生長(zhǎng)速率(mm·d-1)；D為菌落直徑(mm)；t為培養(yǎng)時(shí)間(d)；L為打孔器直徑(mm)。

1.2.3 生物量測(cè)定 按1.2所列配方配置液體培養(yǎng)基。于500 mL三角瓶中分裝250 mL培養(yǎng)液，每種培養(yǎng)基分裝3瓶，即重復(fù)3次，滅菌冷卻后接種紅汁乳菇C2菌株，于(24±1) ℃，180 r·min-1條件下黑暗培養(yǎng)。21 d結(jié)束培養(yǎng)，將搖瓶中的發(fā)酵液倒入抽濾瓶中抽濾。抽濾后的菌絲體放置于烘箱中，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算紅汁乳菇菌絲生物量。

(2)

式中：S為菌絲生物量(g·L-1)；M為菌絲干質(zhì)量(g)；V為發(fā)酵液體積(L)。

1.2.4 生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定 培養(yǎng)至第21 d,測(cè)量固體平板培養(yǎng)基上菌落的直徑，對(duì)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行評(píng)分。菌絲生長(zhǎng)勢(shì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：5級(jí)(+++++)，基外菌絲生長(zhǎng)勢(shì)旺盛、濃密、均勻、不自溶；4級(jí)(++++)，基外菌絲多、較均勻、有輕微自溶現(xiàn)象；3級(jí)(+++)，基外菌絲較多、纖細(xì)、不均勻、自溶；2級(jí)(+++)，基外菌絲稀疏、少、嚴(yán)重自溶；1級(jí)(+)，只有基內(nèi)菌絲，無(wú)基外菌絲，或嚴(yán)重自溶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan法進(jìn)行單因素和多重比較方差分析，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5可知：在固體培養(yǎng)狀態(tài)下，紅汁乳菇C2菌株的菌絲在W3號(hào)培養(yǎng)基上平均生長(zhǎng)速度最快，為1.88 mm·d-1，顯著快于它在其它6種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，其生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好，基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)快，有基外菌絲產(chǎn)生，自溶現(xiàn)象輕微；菌絲生長(zhǎng)速度在W1、W4號(hào)之間無(wú)顯著差異，表明培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀和硫酸鎂含量的改變對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)影響不大。菌絲在W6號(hào)培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速度最慢，僅為0.62 mm·d-1。在液體培養(yǎng)狀態(tài)下，紅汁乳菇菌絲的生物量以W3號(hào)培養(yǎng)基中的最高，達(dá)到1.25 g·L-1；W4、W7號(hào)培養(yǎng)基中的較高，且這兩者間的差異不顯著。W2號(hào)和W3號(hào)培養(yǎng)基中均以葡萄糖和蔗糖作為碳源，其中的菌絲生長(zhǎng)速度和生物量也均較高，可能是能量供應(yīng)持久所致。

表5 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇生長(zhǎng)的影響Tab.5 Effects of different basic medium on the growth of Lactarius lividatus編號(hào)固體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度/(mm·d-1)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)液體培養(yǎng)菌絲生物量/(g·L-1)W11.32±0.02 c++0.72±0.02 dW21.51±0.03 b++1.05±0.02 cW31.88±0.02 a+++1.25±0.06 aW41.29±0.05 c+++1.17±0.07 bW51.02±0.02 d+0.41±0.01 eW60.62±0.04 f+0.28±0.02 fW71.03±0.01 d+++1.14±0.10 b 注: 同列相同字母表示差異不顯著;不同字母表示差異顯著。下同。

紅汁乳菇在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的差異主要表現(xiàn)為基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度的不同，且基外菌絲的生長(zhǎng)速度與基內(nèi)菌絲的不同步。所有基礎(chǔ)培養(yǎng)基上均有菌絲自溶現(xiàn)象，這可能是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不足以支撐紅汁乳菇的旺盛生長(zhǎng)，因此，有必要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加合適的礦物質(zhì)、維生素、激素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以改善紅汁乳菇的生長(zhǎng)狀態(tài)。綜合考慮菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)、生物量等，W3號(hào)為適合紅汁乳菇生長(zhǎng)的較優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知：紅汁乳菇C2菌株在不同優(yōu)化培養(yǎng)基上表現(xiàn)不一。固體平板培養(yǎng)時(shí)，紅汁乳菇菌絲在W19號(hào)培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速度最快，為2.36 mm·d-1，顯著快于它在其它培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，且其基外菌絲較多、分布均勻但纖細(xì)，無(wú)自溶現(xiàn)象；菌絲生長(zhǎng)速度在W14、W15、W16號(hào)培養(yǎng)基之間無(wú)顯著差異，且3種優(yōu)化培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)均較弱。液體培養(yǎng)時(shí)，紅汁乳菇菌絲生物量以W19號(hào)培養(yǎng)基中的最高，達(dá)到1.87 g·L-1；W18、W15號(hào)培養(yǎng)基中的較高，分別為1.72、1.17 g·L-1；W14號(hào)和W16號(hào)培養(yǎng)基上菌絲的生物量無(wú)顯著差異，分別為0.97、0.87 g·L-1。紅汁乳菇C2菌株在W17固體和液體培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。綜合考慮菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)、生物量，W19號(hào)為適合紅汁乳菇生長(zhǎng)的較佳培養(yǎng)基。

表6 優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇生長(zhǎng)的影響Tab.6 Effects of different optimized medium on the growth of Lactarius lividatus編號(hào)固體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度/(mm·d-1)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)液體培養(yǎng)菌絲生物量/(g·L-1)W141.09±0.03 c++0.97±0.09 dW151.24±0.01 c++1.17±0.13 cW161.35±0.15 c+0.87±0.04 dW17///W182.01±0.07 b++1.72±0.12 bW192.36±0.06 a++++1.87±0.06 a

2.3 以PDA為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表7可知：固體培養(yǎng)時(shí)，紅汁乳菇C2菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快、生長(zhǎng)勢(shì)最好，其平均生長(zhǎng)速度為3.05 mm·d-1，且基外菌絲多、菌絲層厚、濃密、均勻、粗壯且不自溶；其次是W24號(hào)培養(yǎng)基上的，其平均生長(zhǎng)速度為2.96 mm·d-1，與PDA培養(yǎng)基上的無(wú)顯著差異，基外菌絲多、較粗壯但分布不均勻、菌絲層薄、不致密、自溶現(xiàn)象嚴(yán)重。W22號(hào)培養(yǎng)基上的菌絲平均生長(zhǎng)速度為2.76 mm·d-1，生長(zhǎng)勢(shì)較好，基外菌絲較多、菌絲層厚度一般、菌絲濃密、潔白、分布均勻，有自溶現(xiàn)象，菌絲自溶圈上可以重新長(zhǎng)出菌絲。W23號(hào)培養(yǎng)基上的菌絲平均生長(zhǎng)速度為2.24 mm·d-1，有基外菌絲、菌絲層薄、較密、纖細(xì)潔白、分布不均勻、自溶現(xiàn)象嚴(yán)重。從液體培養(yǎng)時(shí)的菌絲生物量來(lái)看，PDA培養(yǎng)基中的最大，為2.25 g·L-1，且與其他培養(yǎng)基中的有顯著性差異；其次為W24號(hào)培養(yǎng)基中的，為2.05 g·L-1。紅汁乳菇菌絲在W27號(hào)固體培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在W27號(hào)液體培養(yǎng)中菌絲生物量最低，僅為0.28 g·L-1，可能是培養(yǎng)基中麥芽汁比例過(guò)大所致。

表7 以PDA為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇生長(zhǎng)的影響Tab.7 Effects of different PDA based medium on the growth of Lactarius lividatus培養(yǎng)基名稱固體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度/(mm·d-1)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)液體培養(yǎng)菌絲生物量/(g·L-1)W222.76±0.05 b++++1.90±0.07 cW232.24±0.05 c+++1.62±0.02 dW242.96±0.01 a++++2.05±0.04 bW252.34±0.04 c++1.17±0.07 ePDA3.05±0.06 a+++++2.25±0.05 aW27//0.28±0.02 f

2.4 菌根菌培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

由表8可知：紅汁乳菇C2菌株的菌絲在不同菌根菌培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)不同。固體培養(yǎng)時(shí)，菌絲在BAF培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最快，為2.57 mm·d-1；其次是在PACH培養(yǎng)基上的，為2.51 mm·d-1；在該2種培養(yǎng)基上，菌絲的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異，且顯著快于其他6種培養(yǎng)基上的。BAF培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最好，基外菌絲分布均勻、致密、粗壯、潔白、無(wú)自溶現(xiàn)象。PACH培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)也很好，基內(nèi)菌絲和基外菌絲生長(zhǎng)同步，分布均勻、較粗壯，有輕微自溶現(xiàn)象。HM培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度較慢，為2.27 mm·d-1；生長(zhǎng)勢(shì)較差，基外菌絲稀疏、纖細(xì)、白色、分布較均勻、沒(méi)有自溶現(xiàn)象。在WPM、YMT、改良MMN、YpSs培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度均無(wú)顯著差異。在WPM培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較好，基外菌絲多、白中帶綠、纖細(xì)、不致密、菌絲層薄、分布不均勻、不易老化，不自溶；在YMT培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較差，基外菌絲稀疏、分布不均勻、匍匐狀、纖弱、白色、無(wú)自溶現(xiàn)象；在改良MMN培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)差，基外菌絲稀少、纖細(xì)、菌絲帶褐色、易老化、自溶嚴(yán)重；在YpSs培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)差，僅基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度快，基外菌絲稀少，匍匐于培養(yǎng)基上，有輕微自溶現(xiàn)象，無(wú)法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在MMN培養(yǎng)基上紅汁乳菇的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)很差，基外菌絲稀少、纖細(xì)、易老化、易自溶；菌絲生長(zhǎng)速度最慢，僅為1.34 mm·d-1。

表8 菌根菌培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.8 Effects of different mycorrhizal medium on the growth of Lactarius lividatus培養(yǎng)基名稱固體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度/(mm·d-1)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)液體培養(yǎng)菌絲生物量/(g·L-1)YpSs2.05±0.09 c+0.73±0.04 eWPM1.98±0.03 c++++1.90±0.02 cMMN1.34±0.03 d+0.48±0.03 f改良MMN2.01±0.12 c+0.75±0.04 ePACH2.51±0.14 a+++++2.07±0.19 bHM2.27±0.1 b +++1.92±0.02 cYMT1.98±0.12 c+++1.62±0.09 dBAF2.57±0.01 a+++++2.51±0.02 a

表8還顯示：液體培養(yǎng)時(shí)，BAF培養(yǎng)基中的紅汁乳菇C2菌株的菌絲生物量最大，為2.57 g·L-1，菌絲為短棒狀，較小，便于直接用于菌劑制作；其次為PACH培養(yǎng)基中的，其菌絲的生物量為2.07 g·L-1；HM、WPM培養(yǎng)基中的菌絲生物量分別為1.92 g·L-1和1.90 g·L-1，該2種培養(yǎng)基中的菌絲生物量無(wú)顯著性差異；YMT培養(yǎng)基中的菌絲生物量為1.62 g·L-1，菌絲球顆粒較大；改良MMN、YpSs培養(yǎng)基中的菌絲生物量分別為0.75 g·L-1和0.73 g·L-1，該2種培養(yǎng)基中的菌絲生物量也無(wú)顯著性差異；MMN培養(yǎng)基中的菌絲生物量最低，僅為0.48 g·L-1。總體來(lái)看，適合C2菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為BAF和PACH。

2.5 在不同固體培養(yǎng)基上不同紅汁乳菇菌株菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)

根據(jù)以上結(jié)果，選擇生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)綜合效果較佳的W3、W19、W22、W23、W24號(hào)和BAF、PACH、WPM、PDA培養(yǎng)基以及使用較普遍的MMN培養(yǎng)基，共10種培養(yǎng)基，以固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)11個(gè)紅汁乳菇菌株(菌株編號(hào)：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH7、JH8、JH10、JH11、JH12、JH13)。結(jié)果(圖1和表9)顯示：所有的供試紅汁乳菇菌株均能在W22、W24號(hào)和BAF、PACH、PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲平均生長(zhǎng)速度為0.87～2.35 mm·d-1；所有菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)勢(shì)均較好、生長(zhǎng)均較旺盛，表明PDA培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富、配比合理，是培養(yǎng)紅汁乳菇的首選固體培養(yǎng)基。11個(gè)供試菌株中的10個(gè)菌株均能在W19、W23號(hào)和WPM固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲平均生長(zhǎng)速度為1.09～1.49 mm·d-1；只有8個(gè)菌株能在W3號(hào)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲平均生長(zhǎng)速度為1.18 mm·d-1；只有5個(gè)菌株能在MM固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲平均生長(zhǎng)速度為0.86 mm·d-1。

圖1 不同紅汁乳菇菌株菌絲在不同固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度Fig. 1 The growth rate of 11 strains of Lactarius lividatuson different solid medium

表9 不同紅汁乳菇菌株在不同固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)勢(shì)Tab.9 The mycelium growth vigor of different strains on different solid medium菌株菌絲生長(zhǎng)勢(shì)W3W19W22W23W24BAFMMNPACHWPMPDAJH1++++++++/++++++++++++JH2+++++++++++++++++++++++JH3/++++++++++++++/+++/++++JH4+++++++++++++++++++++++++++++++JH5++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++JH7+++++++++++++++/++++++++++++JH8/++++++++++++++++++++++++++JH10/++/+++++/+++++++++++JH11++/+++++++/+++++++++++++JH12+++++++++++++++++++++++++JH13++++++++++++/++++++++++++++

11個(gè)紅汁乳菇菌株中，JH5菌株在所有供試培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)均優(yōu)，是1個(gè)優(yōu)良菌株。此菌株現(xiàn)注冊(cè)保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號(hào)為19369。

3 結(jié)論與討論

選擇和優(yōu)化合適的培養(yǎng)基是菌株培養(yǎng)的前提。觀察表明，活力強(qiáng)的紅汁乳菇菌株在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌絲生長(zhǎng)勢(shì)應(yīng)該具有基外菌絲粗壯、菌絲層厚、菌落邊緣整齊、濃密、不自溶、白色或白綠色或肉紅色等特征。本文作者用已報(bào)道的27種培養(yǎng)基培養(yǎng)紅汁乳菇，通過(guò)對(duì)其菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)和生物量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，PDA固體培養(yǎng)基表現(xiàn)最佳，BAF液體培養(yǎng)基表現(xiàn)最佳。參試的11個(gè)紅汁乳菇菌株中，JH5具有良好的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性，生長(zhǎng)勢(shì)最好，生長(zhǎng)速度最快，是1個(gè)優(yōu)良菌株，具有進(jìn)一步挖掘的潛力。

根據(jù)紅汁乳菇菌株在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)勢(shì)的表現(xiàn)，我們推測(cè)，紅汁乳菇有自己獨(dú)特的生長(zhǎng)特性。當(dāng)固體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，紅汁乳菇菌絲向培養(yǎng)基深層生長(zhǎng)，攝取營(yíng)養(yǎng)；營(yíng)養(yǎng)足夠時(shí)，基內(nèi)菌絲冒出，基外菌絲旺盛生長(zhǎng)。如在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，紅汁乳菇菌絲均以基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)為主，基外菌絲較少，自溶現(xiàn)象普遍。當(dāng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)過(guò)?；蛘弑壤缓侠頃r(shí)，紅汁乳菇菌絲不僅受到抑制，也會(huì)產(chǎn)生自溶。如在添加了磷酸二氫鉀、蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)成分的W22、W23、W24、W25號(hào)培養(yǎng)基上，紅汁乳菇菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)就不如PDA的。這與李忠海等[23]發(fā)現(xiàn)松乳菇菌絲在PDA上生長(zhǎng)勢(shì)最好的結(jié)論相似。W24號(hào)和W27號(hào)培養(yǎng)基均以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加VB1后，紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)并未得到促進(jìn)。這印證了李文藝[5]認(rèn)為PDA培養(yǎng)基含有松乳菇菌絲生長(zhǎng)所需的足量維生素的結(jié)論，也與趙洪等[24]關(guān)于PDA培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)因子對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯促進(jìn)作用的結(jié)果一致?？梢?jiàn)，紅汁乳菇菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)對(duì)培養(yǎng)基成分和配比有明顯的依賴性。值得注意的是，W22號(hào)和WPM培養(yǎng)基上，自溶圈上能重新長(zhǎng)出菌絲，這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。

從C2菌株菌絲生長(zhǎng)情況來(lái)看，在含有麥芽汁成分的培養(yǎng)基上，其菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)均較差，初步推斷，可能是麥芽汁中的某些成分不利于紅汁乳菇C2菌株菌絲的生長(zhǎng)。自1996年Marx[19]報(bào)道適宜于外生菌根真菌生長(zhǎng)的MMN培養(yǎng)基以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者視其為經(jīng)典，廣泛用于分離培養(yǎng)外生菌根菌菌種。但筆者采用MMN培養(yǎng)基培養(yǎng)紅汁乳菇時(shí)，發(fā)現(xiàn)其菌絲生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間需35 d以上，無(wú)法滿足規(guī)模生產(chǎn)要求。這與劉君昂[25]利用MMN培養(yǎng)基培養(yǎng)紅汁乳菇，其菌絲生長(zhǎng)較迅速且旺盛的結(jié)論不同。推測(cè)可能是培養(yǎng)基中麥芽汁抑制了菌根菌菌絲生長(zhǎng)所致。為此，筆者曾嘗試將與MMN培養(yǎng)基中劑量相同或減半的麥芽汁加入PDA、BAF、PACH、WPM、YMT培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅汁乳菇，發(fā)現(xiàn)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)均受抑制，表現(xiàn)為只長(zhǎng)基內(nèi)菌絲且嚴(yán)重自溶，從而印證了上述推測(cè)。

采用經(jīng)驗(yàn)證表現(xiàn)良好的10種培養(yǎng)基，對(duì)11個(gè)紅汁乳菇菌株進(jìn)行平板培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同菌株在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)不一，推測(cè)其原因可能是不同菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求不同。楊平等[10]、張疏雨等[11]試驗(yàn)篩選出的紅汁乳菇培養(yǎng)基配方差異較大，也認(rèn)為其原因歸于菌株不同。因此，針對(duì)特定菌株，優(yōu)化與之匹配的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件很有必要。由此推知，對(duì)于其它菌根性食用菌菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)基的選擇和菌株的篩選同樣重要。