田雙娥

(廣西民族博物館，廣西南寧 530028)

0 引 言

霉菌病害是館藏文物，如棉、麻、毛、絲、紙質(zhì)、竹木、皮革等的主要微生物病害之一。霉菌以有機(jī)質(zhì)文物為養(yǎng)分，發(fā)達(dá)的菌絲體覆蓋文物，新陳代謝產(chǎn)物有機(jī)酸會腐蝕文物，還會代謝出色素污染文物，還能產(chǎn)生消化分解有機(jī)物質(zhì)的纖維素酶，致使文物受到損壞。因此，防治文物霉菌病害，研發(fā)天然、安全、環(huán)境友好型的抗菌防霉劑成了國內(nèi)外文物保護(hù)工作者的研究熱點(diǎn)。

植物精油又稱為香精油、揮發(fā)油，是萃取植物特有的芳香味兒油狀液體，取自于草本植物的花、葉、根、樹皮、果實(shí)、種子、樹脂等，以蒸餾、壓榨和溶劑萃取等方式提煉出來[1]。植物精油具有多種生物學(xué)活性，如抗菌、抗氧化、殺蟲等，在食品、制藥、香料等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。大量研究表明，植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能抑殺細(xì)菌、真菌和病毒[2]。植物精油及其活性成分對真菌的抑制作用表現(xiàn)在抑制真菌的生長和真菌毒素合成[3-5]。

本工作研究了羅勒、香葉和山蒼子三種精油對供試霉菌的抑菌活性，采用GC-MS分析了三種精油的主要化學(xué)成分，以期為植物精油及活性成分作為新型綠色防霉抑菌劑在博物館館藏文物的微生物病害防治工作中應(yīng)用提供新的思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅勒精油、香葉精油、山蒼子精油(上海維塔化學(xué)試劑有限公司)。紗紙(廣西貢川)，宣紙(安徽涇縣)，A4紙。

霉菌液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；蛋白胨：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真菌提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。所用儀器名稱和型號如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器和型號Table 1 Instrument and model

1.3 方法

1.3.1真菌分離 霉菌的分離、純化用沙氏液體培養(yǎng)基和葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基分別滅菌后備用。

霉菌的取樣采用自然沉降法[6]。從展廳帶回的平板置于28 ℃、70%RH的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d。提取優(yōu)勢菌落進(jìn)行多次劃線，直至得到純菌落。

1.3.2真菌DNA的提取 將平板上純化的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃振蕩器中180 r·min-1培養(yǎng)。將過濾后的菌絲體烘干，使用液氮研磨后采用天根試劑盒提取霉菌DNA。將獲得的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3真菌ITS 基因片段的PCR擴(kuò)增及測序采用真菌核糖體rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1和ITS4，對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌ITS基因片段擴(kuò)增的引物序列[7-8]為ITS1，5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’和ITS4，5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’。

PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；PCR變性94 ℃ 30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增體系如下：Premix PCR Taq酶12.5 μL，濃度為10 μmol/L的引物ITS1、ITS4各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL，共25 μL。PCR產(chǎn)物與載體連接克隆，挑取陽性克隆子測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.4真菌18S rDNA序列分析 測序結(jié)果經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源性比較，根據(jù)比較結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定霉菌。

1.3.5抑菌活性試驗(yàn) 孢子懸液、試驗(yàn)平板的制備和抑菌圈大小的測量見參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.6植物精油最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 在5 mL的霉菌液體培養(yǎng)基中加入100 μL孢子懸液。將無水乙醇稀釋成10%的精油添加到試管中，使植物精油稀釋成不同濃度，用無水乙醇做對照。試管置于180 r/min 28 ℃的恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)，120 h后觀察生長情況，不長菌的最小植物精油濃度定義為該植物精油的最低抑菌濃度(MIC)。MBC為在MIC基礎(chǔ)上吸取100 μL培養(yǎng)液進(jìn)行涂布，培養(yǎng)后完全無菌生長的最低精油濃度。實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次。

1.3.7植物精油用于紙張防霉性評價(jià) 將3 000 μL/L的待試精油分別均勻噴于紗紙、宣紙和A4紙的表面并密封，30 min后取出，待精油晾干后將孢子懸液均勻噴涂待試紙張，然后將其置于溫度28 ℃，95%RH的恒溫恒濕箱內(nèi)，培養(yǎng)28 d，記錄試樣紙長霉情況。

1.3.8香葉精油的GC-MS分析 色譜條件：HP-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm彈性石英毛細(xì)管柱；載氣為高純氦氣。

程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min速率升至250 ℃(41 min)。進(jìn)樣口溫度230 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為100∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃；掃描范圍為29～350 u；溶劑延遲3 min。

數(shù)據(jù)庫：采用NIST 08譜庫檢索。

1.3.9羅勒和山蒼子精油的GC-MS分析 色譜條件：毛細(xì)管色譜柱HP-35MS 30 m×0.25 mm，0.25 μm，載氣為氦氣。

程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持5 min，然后以8 ℃/min升溫速率升至290 ℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV。離子源溫度300 ℃，MS四極桿溫度，質(zhì)譜接口溫度為250 ℃，掃描范圍為35～400 u，溶劑延遲5 min。

數(shù)據(jù)庫：采用標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST2014檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌的分離純化結(jié)果

2.1.1霉菌形態(tài)觀察 菌株AM01在PDA培養(yǎng)基上(圖1A-1)28 ℃培養(yǎng)7 d，直徑50～60 mm，菌落平坦或近于平坦，質(zhì)地絨狀；菌絲初為白色后逐漸變?yōu)榘稻G色，分生孢子易脫落，分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，分生孢子面深橄欖綠色，滲出液缺乏，反面近于無色，可溶性色素缺乏。

顯微鏡下觀察青霉菌AM01的分生孢子結(jié)構(gòu)如圖1A-2所示，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝通常雙輪生，偶有三輪生或單輪生；?；枯?～4個，彼此通常較緊貼；瓶梗每輪5～8個或更多，幼齡時呈現(xiàn)瓶狀或披針狀，成熟時近圓柱狀，梗頸通常明顯；分生孢子見圖1A-3，分生孢子典型的橢圓形，光滑；分生孢子集成鏈圓柱狀。

菌株AM02在PDA培養(yǎng)基(圖1B-1)28 ℃培養(yǎng)7 d，直徑25～40 mm，中部較厚而其他部分平坦，或有不規(guī)則的皺紋；質(zhì)地絨狀至絮狀；菌絲體黃色；分生孢子結(jié)構(gòu)較少或較多，分生孢子面綠色、灰綠色，近于灰橄欖綠色；滲出液缺乏；反面黃綠色或黃褐色；可溶性色素類似反面顏色。

圖1 博物館空氣分離獲得的霉菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落及形態(tài)特征Fig.1 Filamentous growth and morphological characteristics of airborne mould isolated from museumon PDA solid media

顯微鏡下觀察AM02的分生孢子結(jié)構(gòu)如圖1B-2所示。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)和氣生菌絲，帚狀枝典型雙輪生，偶有單輪生或不規(guī)則者；?；枯?～8個或更多，彼此緊貼且長短基本一致；瓶梗每輪5～10個，瓶狀，梗頸短；分生孢子見圖1B-3，分生孢子通常呈現(xiàn)橢圓形，壁平滑或稍粗糙；分生孢子鏈?zhǔn)杷啥灰?guī)則糾纏。

菌株AM03在PDA培養(yǎng)基上(圖1C-1)生長迅速，28 ℃培養(yǎng)3 d菌落直徑達(dá)6.0～8.5 cm，菌落質(zhì)地疏松平坦、呈絲絨狀、無突起，菌落呈圓環(huán)狀，氣生菌絲較多，中心下凹、四周突起、邊緣平坦、背面平坦呈放射狀，生長初期呈白色，后期表面產(chǎn)生深褐色干粉，中心呈黑褐色至黑色、菌落質(zhì)地緊密平坦、呈絲絨狀、無突起，菌落中心呈黑色、四周黃至深褐色，菌落周圍有一圈白色菌絲，背面乳白色，菌落表面有干粉，無滲出液。

顯微鏡下觀察AM03的分生孢子結(jié)構(gòu)如圖1C-2所示。AM03頂囊初生時為球形或輻射形，后呈球形或橢圓形；孢梗莖無色或淡褐色，表面平滑；分生孢子見圖1C-3，分生孢子圓或橢圓形淡褐色，表面粗糙有刺突，串生于小梗頂端，小梗單層，全部表面可育。

根據(jù)以上菌落培養(yǎng)形態(tài)和顯微形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》[10-12]進(jìn)行對比分析，菌株AM01和AM02符合青霉屬的生長特性，可初步鑒定兩株菌為青霉屬(Penicillium)。菌株AM03符合曲霉屬的生長特性，可初步鑒定該菌株為曲霉屬(Aspergillus)。

2.1.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 對獲得的3株真菌的ITS序列測序，得到大小合適的序列3條，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列號MK811098、MK811099和MK811100。獲得的ITS序列在GenBank中進(jìn)行BLAST序列比對，所有序列對應(yīng)Genbank中已知的參考序列的同源性均大于99%，確定了所得序列相似度最高的序列所屬科屬、物種等信息，具體比對結(jié)果見表2。因此，形態(tài)學(xué)特征分析和rDNA-ITS序列分析，確定分離的三株霉菌為草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，梅花狀青霉菌(Penicilliumherquei)，棘孢曲霉菌(Aspergillusaculeatus)。

表2 廣西民族博物館空氣中霉菌18S rDNA基因片段序列比對分析Table 2 Anaysis of 18S rRNA gene sequence in the air environment of Anthropology Museum of Guangxi

2.2 植物精油對霉菌的抑菌效果

測得的抑菌圈大小結(jié)果如表3、圖2所示。抑菌圈直徑>20 mm為極敏感，10～20 mm為中度敏感，5～10 mm為低度敏感，無抑制作用者(≤5 mm)為不敏感[13]。由表3可知，三種精油對供試霉菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，表明供試霉菌對精油的抑菌敏感性為極度敏感，即羅勒精油、香葉精油和山蒼子精油對三種霉菌的抗菌效果明顯。圖2可知，植物精油對霉菌的抑制作用除了抑制菌絲的生長還能抑菌霉菌的孢子生成。

表3 三種植物精油對供試霉菌的抑菌圈直徑Table 3 Antimicrobial activity (inhibition zone)of three tested plant essential oils against moulds (mm)

A1～A3分別表示羅勒精油對草酸青霉、梅花狀青霉和棘孢曲霉的抑菌圈，B1～B3分別表示香葉精油對草酸青霉、梅花狀青霉和棘孢曲霉的抑菌圈，C1～C3分別表示山蒼子精油對草酸青霉、梅花狀青霉和棘孢曲霉的抑菌圈。圖2 抑菌圈照片F(xiàn)ig.2 Photos of inhibition zone test

2.3 MIC和MBC的測定

羅勒精油、香葉精油和山蒼子精油對供試霉菌的MIC和MBC測定結(jié)果見表4。MIC和MBC值越低，表明該精油的抗菌效力越強(qiáng)。由表2可知，同一種霉菌對不同精油的抑菌敏感性不同，同一種精油對不同霉菌的抑菌活性也不同，綜合抗菌效果最好的是香葉精油，MIC值均≤600 μL/L，其次是羅勒精油和山蒼子精油。

表4 植物精油對供試霉菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

2.4 植物精油用于紙張的防霉效果

精油處理過的待試紙張和對照組紙張?jiān)诤銣睾銤裣渑囵B(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)28 d后，對紙張表面霉變情況進(jìn)行觀察并記錄，結(jié)果見表5。

由表5可知，對照組的宣紙、A4紙和紗紙均發(fā)生了明顯霉變，其中霉變較嚴(yán)重的是A4紙，霉變面積達(dá)到20%～50%，宣紙和紗紙次之。A4紙?zhí)幚斫M的霉變面積小于其對照組。宣紙對照組霉變面積為20%～30%，其試驗(yàn)組中山蒼子精油組霉變情況較為嚴(yán)重，霉變面積約為10%，對照組霉變面積大于試驗(yàn)組。待試紙樣中霉變較輕的是紗紙，霉變面積小于5%，低于對照組的10%～20%。所有處理組的紙張霉變程度均比對照組小，精油具有增強(qiáng)紙張防霉效果的作用。

表5 植物精油在紙張上防霉試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Anti-fungal activity of plant essential oils on paper

2.5 植物精油抗菌成分GC-MS分析

按照前文條件，對三種精油分別檢測后進(jìn)行分析，以峰面積歸一化法測定各成分的相對含量。香葉精油總離子流譜圖共顯示56個峰(圖3)，經(jīng)質(zhì)譜庫檢索與標(biāo)準(zhǔn)譜圖共同對照分析，共鑒定出23種化合物，其含量占色譜總流出峰相對百分含量的98.39%，結(jié)果見表6。羅勒精油總離子流譜圖見圖4所示，共鑒定出12種化合物，其含量占色譜總流出峰相對百分含量的99.77%，結(jié)果見表7。山蒼子精油總離子流譜圖見圖5，共鑒定出44種化合物，其含量占色譜總流出峰相對百分含量的98.07%，結(jié)果見表8。

圖3 香葉精油GC-MS分析總離子流譜圖Fig.3 The TIC of GC-MS of essential oil from geranium

表6 香葉化學(xué)成分分析Table 6 Analysis of the chemical components of geranium

圖4 羅勒精油GC-MS分析總離子流圖譜Fig.4 TIC of GC-MS of essential oil from basil

表7 羅勒精油化學(xué)成分分析Table 7 Analysis of the chemical components of basil oil

表8 山蒼子精油化學(xué)成分分析Table 8 Analysis of the chemical components of Litsea cubeba oil

(續(xù)表8)

圖5 山蒼子精油GC-MS分析總離子流圖譜Fig.5 TIC of GC-MS of essential oil from Litsea cubeba

由表6可知，從香葉精油中分離出的揮發(fā)性化合物中，相對含量最高的是香葉醇(56.73%)，其余相對含量較高的依次為橙花醇(38.31%)，α-檸檬醛(0.71%)，約占總化學(xué)成分的95.75%。由表7可知，羅勒精油中相對含量最高的是丁香酚(83.14%)，其次是己二醇(16.15%)，約占鑒定出化學(xué)成分的99.29%。由表8可知，山蒼子精油中相對含量最高的是檸檬醛(36.01%)，其余相對含量較高的依次為(Z)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛(29.71%)，檸檬烯(16.67%)，桉樹醇(2.10%)，香茅醛(1.41%)，石竹烯(1.33%)，芳樟醇(1.21%)，6-甲基-5-庚烯-2-酮(1.17%)，約占鑒定出化學(xué)成分的89.61%。

精油的成分受很多因素影響，不同產(chǎn)地來源[14-16]、不同提取方法[17]，不同葉齡[18]，不同季節(jié)[19]，不同器官、不同品種、采集時間、加工方法、樣品儲藏方式、儲藏時間和不同檢測儀器設(shè)備[20]等因素都會影響精油的含油率和組分。由表6～8可見，經(jīng)GC-MS分析鑒定，本研究中使用的香葉、羅勒和山蒼子精油主要化學(xué)成分別為醇類、酚類和醛類物質(zhì)。

近年來，植物精油或其他植物源提取物受到了文物保護(hù)工作者的廣泛關(guān)注。國內(nèi)多家單位均進(jìn)行了植物精油抑菌防霉、殺蟲等的應(yīng)用研究。唐歡[21]等利用5種植物源提取物，評價(jià)植物源提取物在不同使用劑量下對博物館展廳空氣來源細(xì)菌的抑制效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物源提取物抑菌效果良好。中國羅勒油、香葉油、山蒼子油等均被我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》列入允許使用的食品天然香料名單[22]，也就是說在正常使用的劑量范圍內(nèi)，三種精油不會對人體健康和生命安全造成威脅。但植物源提取物對文物本體的安全性是值得考慮的。王克華等[23]研究了檸檬醛、肉桂醛和香茅醛三種植物成分的防霉活性及其對紙張、顏料的影響，結(jié)果表明三種化合物對球毛殼、黑曲霉和橘青霉有很好的抑制作用，但對文物材質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在色差上，香茅醛不會造成紙張、顏料的色差改變，檸檬醛對紙張的的色差基本沒有影響、對顏料則存在一定程度影響，而肉桂醛則會對紙張及顏料都存在一定程度的影響。由此，植物精油等植物源提取物對文物材質(zhì)的強(qiáng)度和顏料的色差影響等還需進(jìn)行相關(guān)研究。

3 結(jié) 論

經(jīng)形態(tài)學(xué)特征分析和分子生物學(xué)鑒定，從廣西民族博物館空氣中分離的三株霉菌為草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，梅花狀青霉菌(Penicilliumherquei)，棘孢曲霉菌(Aspergillusaculeatus)。比較羅勒精油、香葉精油、山蒼子精油對三種霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三種精油的抑菌效果均較明顯，抑菌效果大小依次為：香葉精油>羅勒精油>山蒼子精油，綜合抗菌效果最好的是香葉精油。精油用于紙張抗霉菌具有明顯效果。經(jīng)GC-MS分析，羅勒精油、香葉精油和山蒼子精油的主要活性成分分別為丁香油酚、香葉醇和檸檬醛，精油對霉菌的抗菌活性與精油含有的主要化學(xué)成分有關(guān)，三種精油對霉菌的抑菌機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。植物精油對霉菌的抑菌研究結(jié)果表明，精油在博物館館藏文物的展存環(huán)境微生物污染霉菌的防治中具有良好的開發(fā)潛力。