李蘭杰，張華宸，石婧，魏子翔，張寧，劉桂芹*

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000）（2.聊城大學(xué)生物制藥研究院，山東聊城 252000）

阿膠，由馬科動(dòng)物驢（Equus asinusL.）的皮去毛后經(jīng)過熬制而成的一類膠塊。阿膠具有補(bǔ)血養(yǎng)血、美容養(yǎng)顏、強(qiáng)身健體的作用[1]。阿膠可增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，預(yù)防癌癥，滋養(yǎng)腎陰，也是安胎的良藥，在生活和臨床中具有廣泛的用處[2]。

隨著人類的生活水平的快速提高，阿膠越來越受到人們的青睞，擁有廣大的市場(chǎng)和光明的發(fā)展前景[3]。由于驢皮資源有限，阿膠、驢皮的價(jià)格持續(xù)推高，因此，以其它動(dòng)物皮制備阿膠的現(xiàn)象普遍存在。此類事件給正品阿膠的推廣以及消費(fèi)者帶來巨大的沖擊和憂慮，同時(shí)對(duì)阿膠的質(zhì)量控制帶來新的考驗(yàn)和挑戰(zhàn)。

目前對(duì)于阿膠熬制所用原料-驢皮的鑒別方法主要有物理鑒別法、化學(xué)成分分析法、驢屬DNA 和驢源特異性肽段的檢測(cè)等。史兆松等[4]基于光學(xué)手段用哈氏切片器對(duì)待測(cè)驢皮，馬皮和牛皮的附屬物毛進(jìn)行切片，采用光學(xué)顯微鏡觀察，對(duì)比各動(dòng)物毛纖維表面及橫切面的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果差異明顯，可作為毛皮種類的鑒別依據(jù)。田俊生等[5]利用核磁共振（NMR）代謝組學(xué)技術(shù)，從驢皮、馬皮、騾皮中提取水溶性成分，在得出的42 種水溶液成分中，三者的含量差異很大，因此可以將三種皮區(qū)別開。Xue 等[6]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，比對(duì)了多個(gè)物種的皮源性特異性蛋白的成分，成功的用于檢測(cè)是否用非驢皮來熬制阿膠產(chǎn)品。史碧云等[7]通過建立驢皮藥材RAPD 分析方法并用于偽品馬皮的鑒別，其RAPD 反應(yīng)結(jié)果中，300～400 bp 處的條帶具有特異性，可作為鑒別驢皮及其偽品的依據(jù)。Zhao 等[8]研究中利用細(xì)胞色素c 氧化酶亞基I 型基因聚合酶鏈反應(yīng)，為阿膠所用的原料包括驢皮、馬皮、騾皮、牛皮和豬皮做出了鑒定。另外，嚴(yán)華等[9]的研究中采用細(xì)胞色素c 氧化酶亞基1 基因片段序列的方法，鑒定區(qū)別阿膠所用原材料驢皮及其偽品（馬皮、牛皮），并通過鄰接法構(gòu)建出系統(tǒng)樹，結(jié)果表明驢皮、馬皮、牛皮的樣品中具有比較好的單系性，均分別獨(dú)立聚為一個(gè)分支，能夠顯著區(qū)別開。王芳等[10]利用生物學(xué)軟件模擬和超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜等技術(shù)，對(duì)牛、驢、豬的皮中來源I型膠原蛋白α1 鏈酶解肽段進(jìn)行了分析對(duì)比，成功篩選出了12 個(gè)關(guān)于驢皮的特異性肽段。鞏麗萍等[11]、石峰等[12]利用序列比對(duì)技術(shù)，得到了理論馬皮膠原蛋白特征肽以及驢皮特征肽，其再利用胰蛋白酶酶切樣品，通過采用納升液相-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，明確阿膠特征肽GPTGEPGKPGDK和馬皮特征肽GASGPAGVR，成功的建立了檢測(cè)阿膠中驢皮源和馬皮源成分專屬性的方法。

通過上述方法進(jìn)行驢皮的質(zhì)量控制，在一定程度上遏制了在阿膠中摻雜馬皮、牛皮、羊皮等其他種屬動(dòng)物皮的現(xiàn)象，同時(shí)也存在諸多不足，如耗時(shí)較長(zhǎng)、前處理繁瑣、檢測(cè)成本高等。不同種屬動(dòng)物的脂肪酸組成及含量均存在差異性。胡晶紅等[13]利用GC-MS方法，對(duì)驢、牛、馬的皮脂成分進(jìn)行了分析，其研究表明驢皮皮脂中飽和脂肪酸占88.82%，而不飽和脂肪酸占2.69%；牛皮皮脂中飽和脂肪酸占37.62%，而不飽和脂肪酸占39.74%；馬皮皮脂中飽和脂肪酸占45.15%，而不飽和脂肪酸占50.31%。驢皮是以飽和脂肪酸為主，主要由棕櫚酸、(E)-9-十八碳烯酸、硬脂酸和8-十八碳烯酸構(gòu)成；馬皮與牛皮是由飽和及不飽和脂肪酸構(gòu)成，兩者最大量不飽和脂肪酸均為(E)-9-十八碳烯酸，其余的成分馬皮主要含(Z)-9-十六碳烯酸、硬脂酸和十六酸，而牛皮中主要含9-十六碳烯酸、對(duì)苯二甲酸和棕櫚酸，可為區(qū)分驢皮，馬皮和牛皮提供參考依據(jù)。因此，基于皮脂中脂肪酸組成的分析來進(jìn)行不同種屬動(dòng)物皮的鑒別在理論上切實(shí)可行。

本文首先對(duì)不同動(dòng)物的皮脂進(jìn)行提取，然后對(duì)其脂肪酸進(jìn)行甲酯化預(yù)處理，并利用氣相色譜法初步構(gòu)建了驢皮、羊皮、牛皮中脂肪酸成分的指紋圖譜，并對(duì)驢皮中特異性脂肪酸肉豆蔻酸和棕櫚油酸進(jìn)行了含量測(cè)定，以期為驢皮的真?zhèn)慰焖勹b別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢皮，購(gòu)自東阿縣新城曲山驢肉直營(yíng)店；羊皮、牛皮，購(gòu)自聊城市東昌府區(qū)龍山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

14%三氟化硼-甲醇、十七烷酸甲酯、2,2-二甲基丙烷、37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)等試劑，購(gòu)自sigma 公司。正己烷、乙酸乙酯、乙醚等藥品試劑都是分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

氣相色譜儀（7890B），美國(guó)Agilent；氮吹儀（MD200），杭州奧盛；脂肪測(cè)定儀（SOX406），濟(jì)南海能；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX9140MBE），上海博迅；脂肪測(cè)定儀（SOX406），濟(jì)南海能；高速分散器（T18），德國(guó)IKA；真空泵（SHZ-D），河南予華；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52-86A），上海亞榮。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物皮脂的提取

將樣品進(jìn)行刮毛、除脂處理，得到干凈光滑的皮，用剪刀將其剪成5.00 mm×5.00 mm 碎片，放入烘箱烘干（80 ℃，5 h）。用粉碎機(jī)粉碎干燥好的皮樣小顆粒，稱取15.00 g樣品放入250 mL圓底燒瓶中，加入150.00 mL 乙酸乙酯常溫?cái)嚢?4 h，抽濾得濾液，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，回收溶劑后得到三種動(dòng)物皮樣的油脂。

1.3.2 脂肪酸的甲酯化

根據(jù)周光宏等[14]方法，分別取三種皮樣的油脂10.00 mg，加入14%三氟化硼-甲醇溶液2.00 mL，滴入2,2-二甲基丙烷幾滴，此時(shí)需要進(jìn)行水浴30 min，溫度設(shè)定為60 ℃，目的是使脂肪酸完全甲酯化。待其冷卻后加入正己烷1.00 mL、水1.00 mL，隨之將其充分震蕩，待其靜置分層后充分吸取有機(jī)層，加入十七烷酸甲酯正己烷溶液，濃度為400 μg/mL，量為0.10 mL。氮吹儀吹干后，加入正己烷400 μL 進(jìn)行溶解，然后進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。

1.3.3 氣相色譜分析

根據(jù)劉桂芹等[15]的方法，氣相色譜分析的配置及條件如下：Agilent 7890B 型氣相色譜儀，Agilent 7683型自動(dòng)進(jìn)樣器，TR-FAME柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，Thermo 公司）；進(jìn)樣口溫度280 ℃，火焰離子檢測(cè)器（FID）溫度260 ℃；柱升溫程序：140 ℃保持5 min，140 ℃～240 ℃，4 ℃/min，240 ℃保持15 min；載氣：高純氮?dú)?，流速?.00 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL，分流比：1:40。

根據(jù)37 種脂肪酸甲酯色譜圖，定性分析脂肪酸的種類；根據(jù)內(nèi)標(biāo)物十七烷酸甲酯的峰面積，定量分析脂肪酸含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2003、Origin 7.5 和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 驢皮、羊皮、牛皮皮脂氣相色譜指紋圖譜分析

指紋圖譜包含了樣本中脂肪酸的所有信息，對(duì)于驢皮、羊皮、牛皮皮脂脂肪酸的定性分析具有重要意義。利用色譜工作站，對(duì)未加內(nèi)標(biāo)物樣本中的脂肪酸進(jìn)行氣相色譜指紋圖譜比較分析，其結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，驢皮和牛皮皮脂中脂肪酸氣相色譜指紋圖譜具有很高的相似性，除驢皮中含有特有成分C16:1X（24.44 min）和C20:1n9（32.60 min）外，其它脂肪酸成分完全吻合。羊皮皮脂的氣相色譜指紋圖譜則表現(xiàn)出一定的差異性。在短鏈和中鏈脂肪酸區(qū)，羊皮皮脂中含有的脂肪酸種類豐富，如在12.66 min處出現(xiàn)了驢皮、牛皮皮脂中均不存在的特異峰癸酸（C10:0），且含量較高；在15.50 min 處，羊皮皮脂中含有的月桂酸（C12:0）明顯高于驢皮和牛皮；而在20.10 min 處，羊皮皮脂中含有的肉豆蔻酸（C14:1）則明顯低于驢皮和牛皮。在長(zhǎng)鏈區(qū)，驢皮、牛皮皮脂中無明顯峰出現(xiàn)，在35.70 min 處，羊皮皮脂中出現(xiàn)了二十四碳酸（C24:0）。驢皮皮脂中出現(xiàn)的特異性脂肪酸C16:1X（24.44 min）和C20:1n9（32.60 min）需經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)。

圖1 驢皮、羊皮、牛皮皮脂中脂肪酸氣相色譜指紋圖譜Fig.1 The GC fingerprint analysis of fatty acid component in donkey skin,sheepskin and cowhide

2.2 驢皮、羊皮、牛皮皮脂中脂肪酸相對(duì)含量測(cè)定

利用色譜工作站，對(duì)無內(nèi)標(biāo)物（十七烷酸甲酯）的驢、羊、牛皮的皮脂中脂肪酸成分進(jìn)行氣相色譜分析，利用面積歸一化法測(cè)定皮脂樣品中脂肪酸的相對(duì)含量。結(jié)果從驢皮、羊皮與牛皮皮脂中共檢出43、45和40 種脂肪酸成分，高于目前的研究。胡晶紅等[13]從德州烏驢皮中檢出23 種脂肪酸類成分；在牛皮中檢出23 種脂肪酸。李昊等[16]從小尾寒羊肌肉組織的脂肪酸的含量中共檢出31 種脂肪酸。本文中相對(duì)含量超過1.0%的脂肪酸分別有8（驢皮）、11（羊皮）、和7（牛皮）種，相差不大，結(jié)果如表1 示。

由表1 可知，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中含量較高的脂肪酸為油酸（32.30%、21.97%、30.87%）、棕櫚酸（26.33%、19.48%、25.70%）和亞油酸（12.90%、18.51%、12.68%），其中牛皮皮脂中的棕櫚油酸含量也較高，為13.46%。根據(jù)胡晶紅等[14]的研究，驢皮中含量較高的脂肪酸為棕櫚酸25.00%，8-十八碳烯酸16.65%，硬脂酸12.64%；牛皮中含量較高的脂肪酸為(E)-9-十八碳烯酸28.88%，棕櫚酸23.85%，對(duì)苯二甲酸11.34%，與本研究結(jié)果稍有差異。分析原因可能與驢皮油脂的提取方法有關(guān)。根據(jù)張秀媛等[17]的研究，小尾寒羊皮下脂肪中含量較高的脂肪酸為油酸55.53%，棕櫚酸16.84%，硬脂酸9.26%，則與本研究結(jié)果基本一致。另外，本研究中在驢皮中檢出了二十一碳酸（0.49%）成分，與樊雨梅等[18]研究關(guān)于二十一碳酸為羊油和牛油特有的脂肪酸的表述不一致。

表1 驢皮、羊皮與牛皮中脂肪酸相對(duì)含量Table 1 The relative content of fatty acid in donkey skin,sheepskin and cowhide

根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中飽和脂肪酸含量分別是34.59%、42.77%、32.27%，不飽和脂肪酸含量分別是58.83%、47.03%、62.38%；驢皮皮脂和牛皮皮脂中不飽和脂肪酸所占的比例相差不大，并且含量較高，相比之下羊皮皮脂中脂肪酸飽和程度較高。根據(jù)胡晶紅等[13]通過GC-MS 的方法測(cè)定不同動(dòng)物皮脂肪中的主要成分可得，德州烏驢皮脂中飽和脂肪酸占88.82%，不飽和脂肪酸占2.69%；牛皮皮脂中飽和脂肪酸占37.62%，不飽和脂肪酸占39.74%。與本研究（GC-FID）結(jié)果差異較大，分析原因可能與提取、分析方法有關(guān)，GC-MS 的方法在定性分析方面具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，但在定量分析中并不具有優(yōu)勢(shì)。根據(jù)張秀媛等[17]研究表明，小尾寒羊皮下脂肪中，飽和脂肪酸占32.94%，不飽和脂肪酸占65.52%，則與本研究結(jié)果基本一致。

驢皮、羊皮與牛皮樣品中，肉豆蔻酸與棕櫚油酸的相對(duì)含量差異最為明顯，羊皮中肉豆蔻酸的相對(duì)含量（8.94%）約為驢皮（2.98%）和牛皮（3.03%）的3 倍，而驢皮、牛皮皮脂中棕櫚油酸的相對(duì)含量（9.98%、13.46%）為羊皮（2.78%）的3.6 倍和4.8倍。

2.3 驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量測(cè)定

脂肪酸的相對(duì)含量與皮脂的提取方法、提取溶劑種類等因素有關(guān)，干擾因素較多，難以形成穩(wěn)定的質(zhì)量控制體系，因此，脂肪酸的絕對(duì)含量測(cè)定更具有質(zhì)量控制的意義。本文以十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，利用氣相色譜法對(duì)皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸的含量進(jìn)行了含量測(cè)定。由于三種皮脂樣品中可能含有十七烷酸甲酯，因此對(duì)加內(nèi)標(biāo)物和不加內(nèi)標(biāo)物的樣品分別進(jìn)行了氣相色譜分析，計(jì)算樣品中2 種脂肪酸的含量。結(jié)果如表2 所示。

表2 驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量Table 2 The content of myristic acid and palmitoleic acid in donkey skin,sheepskin and cowhide

由表2 可知，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量差異明顯（p＜0.05）。在肉豆蔻酸含量方面，羊皮（0.46%）最高，牛皮（0.38%）次之，驢皮（0.32%）最低，差異性顯著（p＜0.05）；在棕櫚油酸含量方面，牛皮（1.62%）最高，驢皮（1.07%）次之，羊皮（0.16%）最低，差異性顯著（p＜0.05）。

根據(jù)樊雨梅等[18]研究報(bào)道了驢板油以及羊油、牛油的脂肪酸組成，其中驢油肉豆蔻酸含量1.48%，羊油含量3.78%，牛油含量2.93%。驢油中棕櫚油酸含量3.40%，羊油含量2.05%，牛油含量2.85%。與本試驗(yàn)研究結(jié)果差異較大，原因可能與樣本提取部位不同有關(guān)。

3 結(jié)論

3.1 本文建立了一種基于氣相色譜法的驢皮真?zhèn)慰焖勹b別的方法。動(dòng)物皮脂經(jīng)過提取并進(jìn)行甲酯化處理，利用氣相色譜法初步構(gòu)建了驢皮、羊皮、牛皮中總脂肪酸成分的指紋圖譜，通過面積歸一化法測(cè)定驢、羊、牛皮中各種脂肪酸的相對(duì)含量。結(jié)果表明，含量超過2%的脂肪酸依次為：1）驢皮，油酸32.30%、棕櫚酸26.33%、亞油酸12.90%、棕櫚油酸9.98%、硬脂酸4.36%、肉豆蔻酸2.98%、反油酸2.55%。2）羊皮，油酸21.97%、棕櫚酸19.48%、亞油酸18.51%、肉豆蔻酸8.94%、硬脂酸7.72%、棕櫚油酸2.78%。3）牛皮，油酸30.87 棕櫚酸25.70%、棕櫚油酸13.46%、亞油酸12.68%、硬脂酸3.54%、反油酸3.43%、肉豆蔻酸3.03%。羊皮的飽和脂肪酸較驢皮和牛皮含量高，牛皮的棕櫚油酸要比其亞油酸含量高，而驢皮的棕櫚油酸含量比其亞油酸含量低。另外，羊皮中肉豆蔻酸的相對(duì)含量約為驢皮和牛皮的3 倍，而驢皮、牛皮皮脂中棕櫚油酸的相對(duì)含量為羊皮的3.6 倍和4.8 倍。依據(jù)此可以將驢皮，羊皮和牛皮區(qū)分開。

3.2 通過內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品中肉豆蔻酸、棕櫚油酸的絕對(duì)含量。結(jié)果表明，肉豆蔻酸含量高低順序?yàn)椋貉蚱?.46%、牛皮0.38%、驢皮0.32%；棕櫚油酸含量高低順序?yàn)椋号Ｆ?.62%、驢皮1.07%、羊皮0.16%。通過數(shù)據(jù)可得三種皮脂中羊皮的肉豆蔻酸含量最高，棕櫚油酸含量最低；驢皮的肉豆蔻酸含量最低；牛皮的棕櫚油酸含量最高。因此，通過動(dòng)物皮脂中豆蔻酸和棕櫚油酸含量差異性分析，可以完成對(duì)驢皮的真?zhèn)慰焖勹b別。