南格利 阮欣宇 王 柳 劉 潔 段麥葉 王 莉 王 歡

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是指肝臟缺血一段時(shí)間后血流再灌注時(shí)引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)、代謝紊亂、氧自由基生成等造成的肝實(shí)質(zhì)損傷［1-2］。目前臨床診斷HIRI 的方法主要有病理檢查、MRI 和肝功能檢測等，但均有其局限，其中病理檢查雖為診斷HIRI的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有創(chuàng)傷性，可能對(duì)肝臟造成損傷［3］。因此，尋求一種更為安全、有效的檢測方法極為重要。超聲造影通過靜脈注射造影劑顯示病變的血液循環(huán)情況，從而評(píng)估病情，克服了常規(guī)超聲對(duì)低速血流敏感性差的不足［4］。本實(shí)驗(yàn)通過探討超聲造影在大鼠HIRI 病情評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，旨在為臨床提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄 性 SD 大 鼠 49 只 ，體 質(zhì) 量 170~210 g，平 均（192.16±10.21）g，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016］。49 只大鼠中，因麻醉、術(shù)中出血過多及未到設(shè)定再灌注時(shí)間點(diǎn)意外死亡7 只，余42 只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為7 組，每組各 6 只，分別為假手術(shù)組和 HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 6個(gè)亞組。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立：15%水合氯醛（西安天正藥用輔料有限公司）腹腔注射麻醉（350 mg/kg）后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部至劍突術(shù)區(qū)備皮消毒，于上腹部正中切口打開腹腔，分離出肝臟左、中葉之肝蒂，使用無創(chuàng)血管夾夾閉肝中葉和左葉處門靜脈、肝動(dòng)脈，阻斷血供，止血鉗夾閉切口臨時(shí)關(guān)閉腹腔。持續(xù)缺血1 h后取出血管夾，再灌注成功后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組未夾閉門靜脈和肝動(dòng)脈，其余實(shí)驗(yàn)方法同上。

2.超聲造影檢查：使用西門子Acuson S 2000 彩色多普勒超聲診斷儀，9L4 線陣探頭，頻率7~12 MHz；造影劑使用意大利博萊科公司生產(chǎn)的SonoVue，加入5.0 ml 生理鹽水稀釋后振蕩混勻成混懸液備用。常規(guī)超聲顯示肝左葉及腹主動(dòng)脈切面，然后開啟超聲造影模式，機(jī)械指數(shù)0.07，深度、增益等參數(shù)在實(shí)驗(yàn)過程中保持不變。將0.2 ml超聲造影劑混懸液注入大鼠尾靜脈，隨后注射0.5 ml生理鹽水，開啟計(jì)時(shí)器并存儲(chǔ)視頻90 s。開啟對(duì)比脈沖序列超聲造影后處理軟件，脫機(jī)處理存儲(chǔ)的視頻。將感興趣區(qū)（region of interest，ROI）置于肝實(shí)質(zhì)，大小設(shè)為5.0~8.0 mm2。軟件自動(dòng)生成超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線（TIC），獲取峰值強(qiáng)度（PI）、曲線下面積（AUC）、達(dá)峰時(shí)間（TP）、平均渡越時(shí)間（MTT）等參數(shù)。每只大鼠選取3個(gè)ROI并重復(fù)測量3次取平均值。

3.實(shí)驗(yàn)室檢查：各組大鼠再灌注后取其下腔靜脈血3 ml，置于4℃冰箱保存2 h，3000 r/min 離心15 min，取其上清液于-80℃下保存，應(yīng)用7600-120 全自動(dòng)生化分析儀（日本HITACHI 公司）檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

4.病理檢查：取各組大鼠肝左葉組織標(biāo)本，10%甲醛液固定后切片，HE 染色后置于CX31 光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察病理組織學(xué)改變。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較行t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、超聲造影檢查結(jié)果比較

HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 組PI、AUC 均低于假手術(shù)組，TP、MTT 均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。隨著HIRI時(shí)間延長，AUC先逐漸降低，于 48 h 時(shí)再升高，TP、MTT 先逐漸升高，于48 h時(shí)再降低。見表1和圖1。

圖1 各組超聲造影圖

表1 各組超聲造影定量參數(shù)比較（）

表1 各組超聲造影定量參數(shù)比較（）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05。PI：峰值強(qiáng)度；AUC：曲線下面積；TP：達(dá)峰時(shí)間；MTT：平均渡越時(shí)間

PI（dB）22.96±1.54 AUC（dB·s）1065.36±48.47 TP（s）27.83±2.05 MTT（s）37.92±2.14 46.85±2.11*45.36±2.98*49.28±3.06*58.43±4.15*62.89±4.56*47.33±2.58*組別假手術(shù)組HIRI組0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 15.35±2.14*16.84±2.39*14.56±2.58*12.12±2.28*9.15±1.84*17.95±2.98*952.28±36.64*910.18±40.36*730.48±45.23*672.84±38.25*581.67±37.55*795.39±53.25*31.75±2.74*33.14±3.18*36.23±3.39*44.08±3.84*48.12±4.06*30.15±2.84*

二、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 組血清 ALT、AST 水平均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。隨著 HIRI 時(shí)間延長，ALT、AST 水平先升高后下降，在6 h 時(shí)達(dá)到峰值。見表2。

表2 各組ALT、AST水平比較（） U/L

表2 各組ALT、AST水平比較（） U/L

與假手術(shù)組比較，*P<0.05。ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

組別假手術(shù)組HIRI組0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h ALT 18.36±3.68 AST 19.04±3.85 118.62±9.38*209.17±20.49*342.89±24.67*189.63±15.25*99.35±12.78*80.19±9.52*122.44±10.72*209.56±16.64*248.35±23.51*156.29±14.33*100.64±12.43*75.35±8.62*

三、病理檢查結(jié)果

假手術(shù)組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞無變性壞死，排列整齊，大小均勻，無中心粒細(xì)胞聚集。HIRI 0.5 h 組肝細(xì)胞水腫變性，肝竇可見大量紅細(xì)胞淤積；HIRI 3 h 組肝細(xì)胞水腫變性，肝竇可見紅細(xì)胞淤積，并可見少量中性粒細(xì)胞；HIRI 6 h、12 h 組肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，肝細(xì)胞水腫變性，逐漸出現(xiàn)灶性壞死，肝竇可見紅細(xì)胞淤積減少，中性粒細(xì)胞增多；HIRI 24 h組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，較12 h 肝細(xì)胞水腫變性減輕，中性粒細(xì)胞增多；HIRI 48 h 組較24 h 組肝細(xì)胞水腫變性減輕，中性粒細(xì)胞減少。見圖2。

圖2 各組病理圖

四、相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，AUC與血清ALT、AST水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.754、-0.808，均P<0.001）；TP與血清ALT、AST水平均呈正相關(guān)（r=0.731、0.709，均P<0.001）；MTT 與血清AST 水平呈正相關(guān)（r=0.718，P<0.001）；PI與血清ALT、AST水平無相關(guān)性。見表3。

表3 超聲造影定量參數(shù)與血清ALT、AST水平的相關(guān)性分析

討 論

HIRI 是由多細(xì)胞、多介質(zhì)聯(lián)合作用產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其對(duì)機(jī)體的損傷程度遠(yuǎn)大于機(jī)體的自我保護(hù)系統(tǒng)，可導(dǎo)致肝功能衰竭，甚至其他器官功能衰竭，嚴(yán)重危害患者身體健康［5］。因此，如何準(zhǔn)確、快速診斷其病情并及時(shí)給予治療極為重要。目前臨床診斷HIRI 的方法主要有病理、MRI 和肝功能指標(biāo)檢測等。其中病理檢查是診斷HIRI 的金標(biāo)準(zhǔn)，但其有創(chuàng)，極易對(duì)患者肝臟造成損傷。MRI 雖能夠明確肝功能的病變性質(zhì)，提供準(zhǔn)確的影像學(xué)檢查資料，但費(fèi)用高，且無法實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測。肝功能指標(biāo)檢測能實(shí)時(shí)監(jiān)測患者的肝功能損傷程度，但無法提供影像學(xué)信息。超聲造影通過靜脈注射造影劑，造影劑再經(jīng)肺循環(huán)到達(dá)各組織的微循環(huán)，顯示病變的血液循環(huán)情況，可對(duì)肝內(nèi)微循環(huán)進(jìn)行無創(chuàng)、可重復(fù)性檢查，能用于定性診斷肝臟腫瘤、評(píng)估肝射頻消融療效等。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 組 PI、AUC 均低于假手術(shù)組，TP、MTT 均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)合病理檢查結(jié)果分析原因?yàn)椋涸俟嘧?.5 h后肝細(xì)胞腫脹導(dǎo)致肝血竇變窄，肝竇內(nèi)紅細(xì)胞淤積導(dǎo)致肝竇中無復(fù)流，使肝血竇內(nèi)阻力升高，肝缺血后再灌注緩慢。再灌注3 h后，出現(xiàn)少量中性粒細(xì)胞，改善了微循環(huán)障礙的通透性，有利于降低肝血竇內(nèi)阻力，再灌注血流流速增快，灌注量增加。再灌注6~24 h 后，肝細(xì)胞水腫加重導(dǎo)致肝竇狹窄，中性粒聚集增多阻塞了肝血竇，導(dǎo)致微循環(huán)障礙更嚴(yán)重，影響再灌注。再灌注48 h 后，肝組織結(jié)構(gòu)自我修復(fù)能力開始發(fā)揮作用，機(jī)體代償逐漸趨于平衡，微循環(huán)障礙逐漸得到改善［6-7］。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 組ALT、AST 水平均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。說明HIRI時(shí)肝細(xì)胞萎縮、壞死，嚴(yán)重影響其肝功能情況，與左嘉瑋等［8］研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著HIRI 時(shí)間延長，血清ALT、AST 水平先升高后下降，于6 h時(shí)達(dá)到峰值。分析原因?yàn)椋篐IRI的發(fā)生表明其微循環(huán)已發(fā)生改變，使得炎癥因子通過血液循環(huán)釋放于肝臟，導(dǎo)致肝臟進(jìn)一步受損，此時(shí)血清ALT、AST 水平逐漸升高，且于 6 h 時(shí)達(dá)到峰值［9］；隨著HIRI時(shí)間的延長，肝功能逐漸恢復(fù)，微循環(huán)得以改善，故血清ALT、AST水平呈下降趨勢。

本實(shí)驗(yàn)Pearson 相關(guān)分析顯示，AUC 與血清ALT、AST水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.754、-0.808，均P<0.001）；TP 與血 清 ALT、AST 水 平 均呈 正 相 關(guān)（r=0.731、0.709，均P<0.001）；MTT 與血清AST 水平呈正相關(guān)（r=0.718，P<0.001）。說明AUC、TP、MTT均能反映肝功能的變化情況，與王雙龍等［10］研究結(jié)果相似。

綜上所述，超聲造影能實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地評(píng)估大鼠HIRI微循環(huán)的變化，對(duì)評(píng)估HIRI的病情具有一定價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅比較了HIRI 不同時(shí)間點(diǎn)超聲定量參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，今后需進(jìn)一步探討隨HIRI時(shí)間延長微循環(huán)的具體變化。