史 瑛，周志磊，2，許錫彪，章國強，胡志明，毛 健，2

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)（紹興）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，浙江紹興 312000；3.紹興女兒紅釀酒有限公司，浙江紹興 312352）

黃酒的釀制工藝保留了其發(fā)酵中產(chǎn)生的營養(yǎng)活性物質(zhì)，我國南方尤其是江浙一帶，相當數(shù)量的人群具有長期飲用黃酒的習(xí)慣，黃酒的酒性溫熱、味甘，具有舒筋活絡(luò)、止痛散寒、溫通經(jīng)脈的功效[1]。黃酒的酒精度低于白酒，引起機體脂質(zhì)代謝的主要成分為酒精，酒精對肝臟的損傷機制與氧化應(yīng)激有關(guān)，當乙醇進入肝臟后，先轉(zhuǎn)化為乙醛，再轉(zhuǎn)化為乙酸，最終轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水排出體外[2-3]。過量飲酒后，體內(nèi)大量酒精的中間代謝產(chǎn)物乙醛會對肝細胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，代謝過程中產(chǎn)生的大量自由基促進了肝細胞的變性、壞死和炎癥細胞浸潤導(dǎo)致肝細胞纖維化[4]。已有研究表明，相比于純乙醇，傳統(tǒng)中國白酒中具有一些功能活性成分，可以通過促進長短鏈脂肪酸的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)腸道菌群如增加Akkermansia及降低Prevotella的豐度等方式對小鼠產(chǎn)生有益功效，顯著改善了小鼠腸屏障功能并緩解了小鼠的酒精性肝損傷狀態(tài)[5]。

黃酒由于其純糧釀造和多種微生物發(fā)酵的特點，因而產(chǎn)生豐富的功能活性物質(zhì)如脂肪酸、黃酮、多酚、氨基酸、低聚糖、多糖和多肽等[6]，其中有些成分需通過胃和小腸代謝發(fā)揮功效，某些成分代謝后在腸道水平發(fā)揮作用，還可以通過物理相互作用和直接去除代謝物來發(fā)揮作用，從而維持生理平衡。例如，通過結(jié)合膽汁酸和排泄合成物，抑制腸肝循環(huán)，進而促進肝臟膽固醇代謝[7]。因此，黃酒中含有大量充分的益于人體健康的功能物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、功能性低聚糖和多糖、多酚物質(zhì)、生物活性肽等，這些功能性物質(zhì)對于低酒精度所產(chǎn)生不利影響的抑制作用[8-9]，以及適量攝入黃酒對血液和肝臟脂質(zhì)代謝的影響作用尚未研究。

因此，本研究采用紹興地區(qū)黃酒作為研究對象，通過小鼠實驗構(gòu)建持續(xù)兩個月飲用黃酒的模型，探究適量飲用黃酒對小鼠血液和肝臟等相關(guān)指標產(chǎn)生的作用，闡明黃酒相比于酒精的飲后特點和代謝機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的飼養(yǎng)

4 周齡SPF 級成年雄性C57BL/6J 小鼠，每只體重約20 g，在江南大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，每組10只，每4～5 只1 籠分籠飼養(yǎng)，以打耳號的方式對小鼠隨機編號。實驗開始前飼養(yǎng)小鼠7 d 以適應(yīng)屏障環(huán)境，實驗過程中環(huán)境溫度維持在23 ℃±2 ℃，相對濕度保持在40 %～60 %，嚴格遵守12 h 的白晝和黑夜循環(huán)標準，小鼠可自由飲水、進食。小鼠隨機分到4 個實驗組，分別是對照組、乙醇組、黃酒1組、黃酒2 組，對照組為每天灌胃0.2 mL 生理鹽水溶液，持續(xù)8 周；乙醇組為每天灌胃15%食用酒精，按乙醇劑量1.6 g/kg 體質(zhì)量溶于0.2 mL 生理鹽水中，持續(xù)8 周；黃酒1 組為每天灌胃黃酒1 號樣品，按乙醇劑量1.6 g/kg 體質(zhì)量溶于0.2 mL 生理鹽水中，持續(xù)8 周；黃酒2 組為每天灌胃紹興黃酒2 號樣品，按乙醇劑量1.6 g/kg 體質(zhì)量溶于0.2 mL 生理鹽水中，持續(xù)8 周。該乙醇劑量換算人體為144 mL（60 kg 成人）。實驗過程中定期記錄小鼠的生理狀態(tài)，稱量體重。實驗結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，對小鼠進行眼球取血，解剖小鼠收集小鼠肝臟等器官組織。

1.2 小鼠血清、肝勻漿的制備

取血后2 h內(nèi)在4 ℃、5000 g條件下離心10 min，收集上清液于EP 管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。在冰上切取約0.1 g 小鼠肝組織（記錄實際稱重），在生理鹽水中潤洗一次，然后收集于EP 管中，按1∶9 的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，組織勻漿后制得10 %肝臟勻漿液，8000 g 離心15 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清和肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)指標測定

血清總膽固醇（TC）檢測試劑盒、甘油三酯（TG）檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒、肝臟丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所有限公司；蛋白濃度檢測試劑盒，購于上海碧云天生物公司。參照試劑盒中說明書上的操作步驟，使用試劑盒中的試劑對小鼠血清和肝勻漿進行操作，然后用酶標儀在要求波長下測定各指標的吸光度。所測指標包括小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C，以及小鼠肝勻漿蛋白濃度、TG、AST、ALT和SOD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 7 軟件進行分析，顯著性使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法。P＜0.05 為具有顯著性差異，采用*或#標記顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒飲后對小鼠血脂指標的影響作用(圖1)

圖1 黃酒飲用8周后對小鼠血清中血脂指標的影響

飲酒后可能產(chǎn)生血清水平的脂質(zhì)代謝紊亂，TG、TC 是重要的2 種脂類物質(zhì)，而肝臟是它們代謝的主要場所，在脂質(zhì)代謝紊亂的過程中，一些介導(dǎo)脂類轉(zhuǎn)運的血清脂蛋白載體含量也往往發(fā)生改變，比如在膽固醇代謝過程中起重要運輸作用的HDL-C 和LDL-C。本研究中，乙醇組的血清膽固醇TC 和甘油三酯TG 含量顯著增加而高密度脂蛋白HDL-C 水平顯著降低，表明為期8 周的15 %純酒精灌胃已導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。黃酒2 組小鼠的血清TC含量顯著低于酒精組，同時TG含量相比于乙醇組顯著降低，且與對照組無顯著差異，表明黃酒2 飲后兩個月肝臟指標均正常。此外，黃酒2 組的TC、TG 和LDL-C 的指標變化均優(yōu)于黃酒1 組。因此，黃酒2 攝入兩個月后相比于乙醇組未導(dǎo)致肝臟指標病變，對酒精攝入引起的小鼠血脂水平調(diào)控起到了一定的改善作用，且比黃酒1 號樣品更加有效。

2.2 黃酒飲后對小鼠肝臟代謝酶水平的影響(圖2)

圖2 黃酒飲用8周后對小鼠肝功能指標的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）為臨床醫(yī)學(xué)上檢驗肝損傷的主要指標，這兩種酶主要存在于肝細胞中，一旦肝細胞受損破裂就會進入血液，導(dǎo)致AST、ALT 水平升高，并且損傷越嚴重，指標水平越高。為期2 個月的純酒精灌胃引起了小鼠肝臟AST含量的顯著升高，證實小鼠肝細胞已受到損傷，而黃酒1 組和黃酒2 組小鼠肝臟AST 含量相比于乙醇組AST含量顯著降低，表明這兩款黃酒對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝異常有一定的改善作用。ALT 指標數(shù)據(jù)也表明，黃酒2 組可以顯著緩解乙醇導(dǎo)致的ALT 指標升高，同時黃酒2 組比黃酒1 組效果更好。

2.3 黃酒飲后對小鼠氧化應(yīng)激水平的影響(圖3)

圖3 黃酒飲用8周后對小鼠氧化應(yīng)激指標的影響

飲酒8 周后測定小鼠肝臟TG 含量，各組均未造成顯著變化?？寡趸芰Ψ矫妫掖冀M、黃酒1組和黃酒2 組均未導(dǎo)致抗氧化水平的降低。超氧化物歧化酶（SOD）為金屬蛋白酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活力反映了機體清除氧自由基的能力，表明黃酒飲后并未損傷肝臟的抗氧化能力。綜上結(jié)果表明，黃酒2 號樣品飲用8 周可緩解純酒精導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)代謝異常情況，相比黃酒1 號樣品更具有恢復(fù)脂質(zhì)代謝異常的作用。這可能是由于黃酒2 號樣品中存在多種活性功能物質(zhì)，且各個醇類、酯類、有機酸類等物質(zhì)間較為平衡[10-11]，可以緩解乙醇導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，后續(xù)可進一步研究。

3 結(jié)論與展望

在適量飲用黃酒8 周的小鼠中，血清指標上，乙醇模型組的血清膽固醇TC 和甘油三酯TG 含量顯著增加，而高密度脂蛋白HDL-C 降低，表明2 個月15 %純酒精灌胃已導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。黃酒2組小鼠的血清TC、TG 含量相比于乙醇組顯著降低，表明黃酒樣品2 攝入兩個月后相比于乙醇組未導(dǎo)致肝臟指標病變，對酒精攝入引起的小鼠血脂水平調(diào)控起到了一定的改善作用，且比黃酒1 號樣品更加有效。肝臟功能指標上，為期2 個月的純酒精灌胃引起了小鼠肝臟AST 含量的顯著升高，黃酒2組可以顯著緩解乙醇導(dǎo)致的ALT指標升高，同時黃酒樣品2 相比黃酒樣品1 更具有恢復(fù)脂質(zhì)代謝異常的作用。綜上所述，黃酒樣品2 可能因其醇類、酯類、有機酸類等物質(zhì)較為平衡，以每日適量（小鼠1.6 g/kg）連續(xù)灌胃8 周后，小鼠的血清和肝臟脂質(zhì)代謝等指標均維持在正常水平，緩解了乙醇導(dǎo)致的部分不利影響，對肝臟的脂質(zhì)代謝作用顯著優(yōu)于黃酒1號樣品。