李文達(dá)，張少婷，方 婷，朱愛華

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)是一種典型的老年性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙及記憶力減退，伴有或不伴有精神行為癥狀。有研究顯示，至2019年全球癡呆癥高達(dá)5 000萬人，預(yù)計2050年將增加至1.52億人[1]，其中阿爾茨海默病是常見的癡呆類型。阿爾茨海默病的發(fā)生與進(jìn)展不但威脅老年人的健康與生活質(zhì)量，同時給家庭帶來精神與經(jīng)濟(jì)的壓力。目前，阿爾茨海默病發(fā)病原因尚未明確，臨床所用的一線治療藥物未改變病人預(yù)期壽命或整體進(jìn)展[2]。阿爾茨海默病在中醫(yī)學(xué)中屬于“癡呆”“呆病”“健忘”等范疇，病機(jī)主要為髓?？仗摗⒛X失所養(yǎng)，伴風(fēng)、火、痰、瘀上擾清竅，以致神機(jī)失用，發(fā)為癡呆[3]。諸多臨床試驗(yàn)表明，中醫(yī)針?biāo)幵诎柎暮Ｄ〉闹委熤芯邆洫?dú)特優(yōu)勢[4-5]。

黃精是百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖[6]，最早記載于《名醫(yī)別錄》：“黃精，味甘、平，無毒，主補(bǔ)中益氣，除風(fēng)濕，安五臟。久服輕身、延年、不饑，長久服用身體輕盈、多年不饑餓”[7]?！兜啦厣裣芍ゲ萁?jīng)》對黃精亦有“寬中益氣，使五臟調(diào)和，肌肉充盈，骨髓堅強(qiáng)，其力倍增，多年不老，顏色顯明，發(fā)白更黑，齒落更生”的描述?？梢婞S精之用與延年益壽相關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究提示，黃精具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抑菌抗炎等作用[8]。基于數(shù)據(jù)挖掘中藥治療阿爾茨海默病的復(fù)方中黃精為高頻次單藥之一[9]。

目前，關(guān)于黃精治療阿爾茨海默病的具體藥理機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興的綜合性系統(tǒng)方法，通過現(xiàn)代計算機(jī)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)、統(tǒng)計學(xué)等，解釋藥物與疾病相互作用的內(nèi)在聯(lián)系，為中藥現(xiàn)代化提供了幫助[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過對黃精及阿爾茨海默病作用靶點(diǎn)的挖掘，探討黃精治療阿爾茨海默病的藥理作用及其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 檢索數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)，UniProt知識庫，基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)，藥物數(shù)據(jù)庫(DrugBank)，PubChem數(shù)據(jù)庫，Swiss Target數(shù)據(jù)庫，Cytoscape 3.7.1軟件，String 11在線軟件，Metascape數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 黃精藥物成分及靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)[11]，檢索關(guān)鍵詞“黃精”，獲取中藥黃精含有的全部活性成分，并對檢出的活性成分進(jìn)行ADME篩選，設(shè)定兩個閾值：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-like，DL)≥0.18，最終獲得黃精的主要活性成分，整理至Excel表格中。

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中選擇“Related Targets”一欄，檢索各個主要活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，并利用UniProt知識庫 (https：www.uniprot.org/)[12]將篩選出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因名；同時在PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]獲取成分的SMILES號，并在Swiss Target平臺(http：//swisstargetprediction.ch/)[14]預(yù)測藥物靶點(diǎn)，選擇概率≥0.12的靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)匯總，建立黃精活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2.2 阿爾茨海默病靶點(diǎn)與交疊靶點(diǎn)的獲取 通過OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)[15]，GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)[16]及DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca)[17]3個平臺，檢索關(guān)鍵詞“Alzheimer′s disease”，查找阿爾茨海默病相關(guān)的靶基因。下載表格并進(jìn)行匯總?cè)ブ?，建立阿爾茨海默病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。將所得的黃精活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行去重整理，與疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行對比，得到藥物-疾病交疊靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，并繪制Venn圖。

1.2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物靶點(diǎn)、交疊靶點(diǎn)及活性成分、疾病之間交互關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1[18]軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并利用“Network analyser”功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｆ渲忻總€節(jié)點(diǎn)(node)代表藥物、疾病、活性成分或靶點(diǎn)蛋白，邊(edge)代表節(jié)點(diǎn)間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值(degree)代表與該節(jié)點(diǎn)連接邊的數(shù)目，即在該網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用String在線軟件(https：//string-db.org/)[19]導(dǎo)入黃精治療阿爾茨海默病的潛在作用靶點(diǎn)，選擇物種為“Homo sapines”進(jìn)行檢索，取置信度設(shè)置為high confidence(0.7)，將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)。

1.2.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將共有靶點(diǎn)基因信息導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/)[20]，設(shè)置參數(shù)input as species：H.sapiens；analysis as species：H.sapiens，對關(guān)鍵靶蛋白分別進(jìn)行生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 黃精藥物成分及靶點(diǎn)信息 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到黃精活性成分共38個，根據(jù)OB值和DL篩選后得到活性成分12個，詳見表1。TCMSP平臺獲得主要活性成分靶點(diǎn)149個，其中HJ1為12個，HJ2為3個，HJ3為38個，HJ4為37個，HJ5為19個，HJ6為15個，HJ7為16個，HJ8為8個，HJ9為1個，HJ10為0個，HJ11為0個，HJ12為0個。經(jīng)Swiss Target平臺補(bǔ)充，共得到潛在基因靶點(diǎn)329個。

表1 黃精主要活性成分

2.2 阿爾茨海默病疾病靶點(diǎn)與交疊靶點(diǎn)信息 在OMIM、GeneCards、DrugBank數(shù)據(jù)庫共獲得與阿爾茨海默病密切相關(guān)的疾病靶點(diǎn)9 846個，其中GeneCards檢索到9 554個基因，DrugBank檢索到85個基因，OMIM檢索到534個基因。選取GeneCards與疾病相關(guān)度≥10的基因靶點(diǎn)后將3個平臺數(shù)據(jù)匯總并去重后得到疾病靶點(diǎn)929個。經(jīng)數(shù)據(jù)平臺收集黃精藥物靶點(diǎn)共329個，去除無驗(yàn)證基因的活性分子，9種活性分子共作用于173個基因靶點(diǎn)。將兩者對比取交集，獲得疾病-藥物交疊靶點(diǎn)共60個，Venn圖見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)Venn圖

2.3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的分析 利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，由71個節(jié)點(diǎn)、174條邊組成，詳見圖2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值和中介中心度進(jìn)行分析，活性成分居前5位的節(jié)點(diǎn)分別是黃芩素(baicalein)，度值95，中介中心度0.41；4，5′-二羥基黃酮(4′，5-dihydroxyflavone)，度值80，中介中心度0.28；β-谷甾醇(beta-sitosterol)，度值52，中介中心度0.22；(2R)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)苯并四氫吡喃-4-酮[(2R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one]，度值33，中介中心度0.06；甘草素(liquiritigenin)，度值29，中介中心度0.05。黃精的多種活性成分作用于多個靶基因，體現(xiàn)黃精治療阿爾茨海默病的多靶點(diǎn)特征。

圖2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(AD為阿爾茨海默病；HJ為黃精。粉色六邊形代表阿爾茨海默病，藍(lán)色八邊形代表黃精，黃色圓形代表黃精的有效成分，橘色不規(guī)則四邊形代表藥物的潛在靶點(diǎn))

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用String平臺與Cytoscape軟件構(gòu)建黃精與阿爾茨海默病交疊靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖3。共包含60個節(jié)點(diǎn)、186條邊，平均度值為6.2，其中，節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)蛋白，邊為各蛋白間互作關(guān)系。PPI網(wǎng)絡(luò)圖表明這些靶點(diǎn)相互聯(lián)系，且多方面協(xié)同作用治療阿爾茨海默病。節(jié)點(diǎn)連接邊數(shù)越多的代表其在網(wǎng)絡(luò)中越重要，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，其中高于平均度值的靶蛋白共有21個，分別為淀粉樣β前體蛋白(APP)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(AKT1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、過氧化氫酶(CAT)、毒蕈堿乙酰膽堿受體M(CHRM1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(CASP8)、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶MTO(MTOR)、一氧化氮合酶2(NOS2)、細(xì)胞色素C(CYCS)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(CASP9)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)、5-羥色胺受體2A(HTR2A)、細(xì)胞色素P 450 2C19(CYP2C19)；度值分別為23，22，20，19，14，13，12，12，12，10，10，9，9，9，8，8，8，8，7，7，7。以上可能為黃精治療阿爾茨海默病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 交疊靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 共有靶點(diǎn)GO富集分析及KEGG通路富集分析 將藥物-疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析。GO生物途徑(biology process，GO-BP)分析共獲得1 277個條目，按照P值取前10個條目，分別是血液循環(huán)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、老化、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、肽鏈絲氨酸磷酸化、神經(jīng)元死亡、對銨離子的響應(yīng)、節(jié)律過程、生長調(diào)節(jié)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)。GO細(xì)胞成分(cellular component，GO-CC)分析共獲得73個條目，按照P值取前10個條目，分別是突觸后、膜筏、細(xì)胞器囊腔、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、線粒體包膜、核包絡(luò)、神經(jīng)肌肉接頭、過氧化物酶體、血小板α顆粒腔、溶質(zhì)液泡。GO分子功能(molecular function，GO-MF)分析共獲得78個條目，按照P值取前10個條目，分別是G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、血紅素結(jié)合、銨離子結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白激酶活性、磷酸酶結(jié)合、腎上腺素能受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶參與凋亡信號通路的研究、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。橫軸按P值排列，縱軸表示包含的基因數(shù)目，詳見圖4。KEGG通路分析共254條，按P值取前20條通路分別為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、5-羥色胺能突觸、鈣信號通路、阿爾茨海默病、可卡因成癮、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、松弛素信號通路、環(huán)腺苷3′，5′-單磷酸(cAMP)信號通路、長壽調(diào)節(jié)途徑、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號、帕金森病、有絲分裂動物、間隙結(jié)、阿米巴、癌組織中的微RNA、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路、腎細(xì)胞癌、膽汁分泌、細(xì)胞周期。詳見圖5。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

3 討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以黃精為研究對象，探討其治療阿爾茨海默的作用機(jī)制。根據(jù)類藥性及口服生物利用度共篩選出12種黃精的藥物成分，其中9種具有對應(yīng)的靶點(diǎn)，主要包括黃酮類[liquiritigenin、baicalein、3′-methoxydaidzein、(2R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one、4′，5-dihydroxyflavone]、皂苷類[diosgenin、(+)-syringaresinol-O-beta-D-glucoside]及植物甾醇類(sitosterol、beta-sitosterol)。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草素(liquiritigenin)具有抗炎、參與酶反應(yīng)、抗菌、抗氧化、抗精神抑郁等作用[21]。黃芩素(baicalein)具有抗炎、抗氧化、抗衰老、保護(hù)線粒體、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)的功能[22-23]。β-谷甾醇(beta-sitosterol)具有清除自由基、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗焦慮、抑制自主活動等作用[24-25]。薯蕷皂苷(diosgenin)具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松、心臟保護(hù)、抗氧化營養(yǎng)神經(jīng)等作用[26]。

由PPI獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)21個，其中富集程度較高的前6種分別是APP、JUN、TP53、AKT1、SRC、RELA。APP即淀粉樣β前體蛋白(amyloid-beta precursor protein)，其變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常表達(dá)及剪切途徑改變，致使Aβ蛋白增加及代謝異常，從而沉積形成老年斑，進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元細(xì)胞缺失等。APP是導(dǎo)致家族性阿爾茨海默病神經(jīng)病理學(xué)表現(xiàn)的因果基因，也是阿爾茨海默病中淀粉樣蛋白假說的核心[27-28]。JUN是轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1)組的一員，通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的功能和表達(dá)控制細(xì)胞存亡[29]。TP53即細(xì)胞腫瘤抗原p53(cellular tumor antigen p53)具有參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、糖代謝及作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的功能[30]，同時與記憶喪失、神經(jīng)變性相關(guān)[31]。AKT1是3種被稱為AKT激酶的緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，具有多種功能，包括調(diào)控機(jī)體的新陳代謝、血管生成、影響突觸可塑性和神經(jīng)元存活等，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[32]。原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)主要參與基因轉(zhuǎn)錄、免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)化[33]。轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)與炎癥、免疫、分化、細(xì)胞生長、腫瘤發(fā)生和凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)[34]。通過分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)與阿爾茨海默病密切相關(guān)，且主要富集于神經(jīng)變性、細(xì)胞凋亡等方面。

GO功能富集分析顯示，黃精可調(diào)控血液循環(huán)、細(xì)胞反應(yīng)與凋亡、衰老、節(jié)律等生物過程。KEGG通路富集分析顯示，黃精通過多條途徑影響阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展。其中5-羥色胺能突觸通路(serotonergic synapse)共12個基因富集，包括ALOX5、APP、CASP3、CYP2C19、HTR2A、MAOA、MAOB、PLA2G4A、PRKCA、PTGS1、PTGS2、SLC6A4。5-羥色胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)多種生理功能的遞質(zhì)之一，其通路涉及較多基礎(chǔ)和高級大腦功能，通過海馬體和前額葉皮層影響認(rèn)知，其活性降低導(dǎo)致認(rèn)知下降并伴有阿爾茨海默病的精神行為變化[35-36]。鈣信號通路(calcium signaling pathway)共有12個基因富集，通過調(diào)控突觸可塑性變化，影響學(xué)習(xí)和記憶；通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，影響信息處理和認(rèn)知；鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制失調(diào)可能影響阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展[37-38]。血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)共8個富集基因，VEGF信號級聯(lián)可激活血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)和細(xì)胞保護(hù)過程，抑制腦淀粉樣血管病變，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活等影響阿爾茨海默病進(jìn)程[39]。松弛素具有保護(hù)心肌、擴(kuò)張血管、血管重塑及抗纖維化的作用，松弛素通路(relaxin signaling pathway)引起多種靶組織細(xì)胞中PI3K、cAMP增加[40]。有研究表明，高表達(dá)的PI3K/Akt可有效對抗Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，減少細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化[41]。cAMP參與細(xì)胞生長和分化、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的調(diào)控，同時cAMP/蛋白激酶a(PKA)信號調(diào)節(jié)與突觸可塑性變化和認(rèn)知行為相關(guān)[42]。

綜上所述，黃精通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療阿爾茨海默病。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)新的富集程度高的靶點(diǎn)基因和新通路，為全面認(rèn)識與治療疾病和中醫(yī)藥現(xiàn)代化拓寬了渠道。本研究為黃精治療阿爾茨海默病提供依據(jù)，也為臨床治療阿爾茨海默病及新型藥物的開發(fā)提供了思路。