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四妙勇安湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響

2022-01-07 06:07樊欽華杜雅薇吳圣賢
關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)膠原主動(dòng)脈

樊欽華,金 榮,杜雅薇,吳圣賢

動(dòng)脈粥樣硬化為腦卒中、心絞痛等多種血管性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)因素,本質(zhì)是慢性炎癥性反應(yīng)過(guò)程[1],斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或破裂繼發(fā)栓塞嚴(yán)重者危及生命。四妙勇安湯是治療熱毒壅盛型脈管炎的經(jīng)典名方,具有清熱活血的功效,近年來(lái)逐漸拓展用于診治心腦血管疾病。細(xì)胞外基質(zhì)為斑塊纖維帽的主體結(jié)構(gòu)組成,是影響斑塊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵部分,骨架以血管平滑肌細(xì)胞合成的膠原為主[2]。膠原表達(dá)直接決定纖維帽厚薄程度,其表達(dá)減少影響斑塊內(nèi)部構(gòu)成,導(dǎo)致斑塊纖維帽厚度減小。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)具有抗炎、抑制脂肪條紋病變、防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展、調(diào)節(jié)血管細(xì)胞功能的作用[3],是細(xì)胞外基質(zhì),特別是Ⅰ型/Ⅲ型膠原合成的主要調(diào)節(jié)因子[4]。經(jīng)過(guò)血管內(nèi)皮損傷、小血管新生、纖維帽變薄、血管病理性重構(gòu)等環(huán)節(jié)后破壞斑塊內(nèi)部穩(wěn)定結(jié)構(gòu),導(dǎo)致易破損斑塊形成。課題組前期研究顯示,四妙勇安湯治療動(dòng)脈粥樣硬化療效確切[5-6],可有效減輕血管炎癥反應(yīng),抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展,且安全性高[7]。本研究通過(guò)制載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型,觀(guān)察四妙勇安湯對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響,進(jìn)一步探討其對(duì)穩(wěn)定斑塊的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)7~8周齡雄性ApoE-/-小鼠35只及同品系C57BL/6J小鼠10只,體質(zhì)量20~25 g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)室室溫22~24 ℃,相對(duì)濕度50%,光照時(shí)間07:00~19:00。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 辛伐他汀(商品名舒降之,默沙東公司生產(chǎn),批號(hào):20080224)。四妙勇安湯免煎顆粒(含金銀花免煎顆粒、玄參免煎顆粒、當(dāng)歸免煎顆粒、生甘草免煎顆粒,批號(hào)分別為:20081225、20090112、20090218、20081129),由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 兔抗鼠平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(SMα-actin),購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):BA1025 ;二步法免疫組化檢測(cè)試劑(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體),貨號(hào):ZB1901,濃縮型DAB顯色試劑盒,均購(gòu)自北京中衫生物技術(shù)有限公司;天狼星紅(Siriued),美國(guó)Sigma公司產(chǎn),貨號(hào):G1360。旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(jī)(型號(hào)4634)、組織包埋機(jī)(型號(hào)5235)、石蠟溶蠟箱(型號(hào)PM-401)、切片機(jī)(型號(hào)CRM-440)均系日本SAKURA產(chǎn)品;美國(guó)Image-Pro Plus Version 6.0 (IPP6.0)圖像分析軟件。光學(xué)顯微鏡Olympus(型號(hào)BX51)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備動(dòng)脈粥樣硬化模型?;A(chǔ)飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠7~8周,之后改高脂飼料喂養(yǎng)13周后隨機(jī)處死5只,光鏡下觀(guān)察確認(rèn)已形成基礎(chǔ)動(dòng)脈粥樣硬化病變。其余30只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組和四妙勇安湯組,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)19周。以同品系C57BL/6J小鼠10只作為正常對(duì)照組,普通飲食飼養(yǎng)。

1.4.2 給藥方法 按成人與小鼠給藥劑量換算系數(shù)折算小鼠用藥量。辛伐他汀、四妙勇安湯組蒸餾水溶解灌胃。模型組和正常對(duì)照組按體重比例采用生理鹽水灌胃。各組小鼠每日給藥,連續(xù)19周。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 取材 各組小鼠取材前夜禁食,次日按體重3.5%腹腔注射適量水合氯醛麻醉處死。無(wú)菌條件下取出心臟,4%多聚甲醛固定,脫水,常規(guī)石蠟包埋。每只小鼠主動(dòng)脈根部取4個(gè)切面:升主動(dòng)脈最近端橫截面、主動(dòng)脈瓣起始橫截面、主動(dòng)脈瓣附著部位并有冠狀動(dòng)脈開(kāi)口、主動(dòng)脈瓣完全出現(xiàn)并有匯合傾向。切片厚5 μm,每隔100 μm連續(xù)取6張切片。

1.5.2 組織內(nèi)膠原纖維類(lèi)型及分布情況 采取天狼星紅-苦味酸染色。切片常規(guī)脫蠟至水;0.1%飽和苦味酸天狼星溶液染色2 h,流水沖洗10 min;蘇木素復(fù)染1~2 min,取出切片,流水沖洗10 min;最后脫水封片。光學(xué)顯微鏡采集圖像,40倍和200倍鏡下IPP 6.0圖像分析軟件測(cè)量各組小鼠主動(dòng)斑塊內(nèi)膠原含量。

1.5.3 主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(SM-αactin)表達(dá)量 采取免疫組化二步法。SM-αactin一抗稀釋濃度為1∶100,每組取1張磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行陰性對(duì)照。切片脫蠟至水,加入3%的H2O2,經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗、微波修復(fù),再滴加二抗(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體),37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h,PBS沖洗3次,觀(guān)察DAB顯色。40倍和200倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟計(jì)算陽(yáng)性面積占斑塊面積比值,對(duì)斑塊內(nèi)SM-αactin表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.5.4 主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)TGF-β1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)量 選取第3切面,采用Envision免疫組化二步法。TGF-β1、VEGF的抗體稀釋度依次分別為1∶200與1∶200,每組均以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,每張切片分別選取左上、左下、下3個(gè)視野,100倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域累積面積進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算斑塊內(nèi)各指標(biāo)陽(yáng)性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 四妙勇安湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊膠原面積的影響 正常對(duì)照組主動(dòng)脈根部未形成斑塊,四妙勇安湯組斑塊內(nèi)膠原面積增加,辛伐他汀組斑塊內(nèi)膠原面積有一定程度增加。詳見(jiàn)圖1。與模型組比較,辛伐他汀組膠原面積增大,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而四妙勇安湯組斑塊內(nèi)膠原面積增大明顯(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊膠原面積比較(±s) 單位:%

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊膠原面積天狼星紅-苦味酸染色圖(×40)

2.2 四妙勇安湯對(duì)ApoE-/-小鼠TGF-β1、VEGF表達(dá)陽(yáng)性面積的影響 正常對(duì)照組主動(dòng)脈根部無(wú)TGF-β1表達(dá);與正常對(duì)照組比較,模型組斑塊局部TGF-β1表達(dá)明顯增加;與模型組比較,四妙勇安湯組TGF-β1表達(dá)明顯升高(P<0.05)。正常對(duì)照組主動(dòng)脈根部無(wú)VEGF表達(dá);與正常對(duì)照組比較,模型組斑塊局部VEGF表達(dá)升高。模型組與四妙勇安湯組VEGF表達(dá)陽(yáng)性面積比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、圖3、表2。

表2 各組小鼠TGF-β1、VEGF表達(dá)陽(yáng)性面積比較(±s) 單位:%

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)TGF-β1表達(dá)量免疫組化染色圖(×200)

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)量免疫組化染色圖(×200)

2.3 四妙勇安湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊SM-αactin陽(yáng)性面積的影響 正常對(duì)照組主動(dòng)脈根部未形成斑塊,動(dòng)脈中膜無(wú)SM-αactin陽(yáng)性表達(dá)顆粒,模型組和四妙勇安湯組小鼠動(dòng)脈中膜和斑塊纖維帽處可見(jiàn)SM-αactin陽(yáng)性表達(dá)顆粒。詳見(jiàn)圖4。與模型組比較,四妙勇安湯組和辛伐他汀組SM-αactin表達(dá)陽(yáng)性面積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊SM-αactin表達(dá)面積比較(±s) 單位:%

圖4 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊SM-αactin表達(dá)量免疫組化染色圖(×200)

2.4 四妙勇安湯對(duì)ApoE-/-小鼠血管重構(gòu)的影響 與模型組比較,辛伐他汀組和四妙勇安湯組血管內(nèi)彈力膜面積和血管腔面積均呈減小趨勢(shì),但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)外彈力膜面積和血管腔面積比較(±s) 單位:mm2

3 討 論

在血管內(nèi)皮損傷、脂肪條紋病變、炎癥反應(yīng)等多種因素相互作用下形成不穩(wěn)定易破裂的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,是諸多心腦血管系統(tǒng)病變急性發(fā)作的基礎(chǔ),纖維帽變薄、脆弱與血管重構(gòu)是主要的病理特點(diǎn)。血管炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化復(fù)雜的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,白細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞之間的平衡是維持斑塊穩(wěn)定的關(guān)鍵要素[8]。白細(xì)胞,尤其是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞聚集,是從正常血管壁結(jié)構(gòu)向初期動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)變的特征性標(biāo)志[9]。炎癥反應(yīng)辨證屬“熱毒”范圍,四妙勇安湯以金銀花為君,并佐以玄參、當(dāng)歸、生甘草,促進(jìn)血液循環(huán)同時(shí)可有效改善超敏C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6等炎癥介質(zhì),具有較好的抗炎作用。

在病變血管中,以Ⅰ型TGF-β表達(dá)為主,TGF-β1可大量增加于細(xì)胞外基質(zhì)。動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中,脂肪刺激血管平滑肌細(xì)胞肥大、去分化,并增殖遷移至內(nèi)膜,導(dǎo)致血管壁肥厚。模型組小鼠表現(xiàn)的低含量TGF-β1可能導(dǎo)致血管壁中白細(xì)胞聚集。TGF-β在體內(nèi)具有一系列協(xié)同保護(hù)效應(yīng)[3],這種保護(hù)作用喪失可增加脂質(zhì)病變沉積,導(dǎo)致穩(wěn)定的富含細(xì)胞外基質(zhì)的斑塊表型轉(zhuǎn)變?yōu)橛衅屏扬L(fēng)險(xiǎn)的不穩(wěn)定的促炎斑塊[10]。斑塊內(nèi)白細(xì)胞聚集增加,加之其余血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)減少,增加斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)。TGF-β1通過(guò)下游信號(hào)Smad3可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá),進(jìn)而阻止細(xì)胞外基質(zhì)降解[11]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB是通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子A(IκBα)的磷酸化被激活,再經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶刺激從而調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明,四妙勇安湯可降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB,增高核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子A(IκBα)表達(dá),還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9,降低模型小鼠總膽固醇、三酰甘油水平[6,13-14]。本研究結(jié)果顯示,四妙勇安湯組斑塊局部TGF-β1與膠原表達(dá)增加,進(jìn)一步證實(shí)了四妙勇安湯是通過(guò)增加TGF-β1,抑制炎性細(xì)胞聚集,防止脂質(zhì)損傷,并調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB/IκBα/基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá),引起纖維帽血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),抑制膠原分解,促進(jìn)血管纖維化,進(jìn)而維持正常的血管壁結(jié)構(gòu),穩(wěn)定斑塊。VEGF雖未見(jiàn)顯著差異,相較于模型組高VEGF表達(dá)情況,說(shuō)明四妙勇安湯具有減少VEGF趨勢(shì),提示四妙勇安湯可一定程度保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制斑塊內(nèi)血管新生。

血管病理性重構(gòu)是動(dòng)脈粥樣硬化的晚期特征,內(nèi)外因素長(zhǎng)期作用下刺激血管平滑肌細(xì)胞遷移,基質(zhì)金屬蛋白酶降解膠原纖維,細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡重組,導(dǎo)致血管適應(yīng)性動(dòng)態(tài)重塑[15],主要表現(xiàn)為管壁增生肥厚、血管彈力下降等管壁厚度、管徑及血管形狀改變,增加斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)。血管病理性重構(gòu),具備中醫(yī)“瘀血”特征。四妙勇安湯作為活血解毒代表方劑,《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載:“疏其血?dú)?,令其調(diào)達(dá)”,概括了四妙勇安湯抗凝、改善血液循環(huán)、抗氧化、抑制血栓形成的功效。本研究中血管內(nèi)外彈力膜面積與血管腔面積雖未表現(xiàn)出顯著差異,但均明顯縮小,作用強(qiáng)度與辛伐他汀相近,提示四妙勇安湯可一定程度上改善管腔狹窄,穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu),抑制血管重構(gòu)。

破潰斑塊屬于動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程的“痰核毒化期”,此階段的病機(jī)特點(diǎn)是熱毒瘀血互結(jié)致?lián)p[16],動(dòng)脈粥樣硬化與脈管炎皆是血管性病變,破潰斑塊與熱毒壅盛型脈管炎病機(jī)相近,與四妙勇安湯清熱解毒活血的功效、方義相符。本研究結(jié)果顯示,四妙勇安湯主要通過(guò)增加TGF-β1表達(dá)從而增加斑塊內(nèi)膠原含量。TGF-β受體的表達(dá)模式對(duì)已發(fā)生的血管壁改變具有鎖定作用,即使TGF-β活動(dòng)恢復(fù)正常,已分化的內(nèi)膜血管平滑肌細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)而不是恢復(fù)至收縮狀態(tài)來(lái)反映,因而,高含量TGF-β1表達(dá)可形成穩(wěn)定的富含基質(zhì)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[3]。

四妙勇安湯可抑制血管內(nèi)彈力膜面積與血管腔面積增厚,防止病理性重構(gòu),有利于穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)。四妙勇安湯應(yīng)用于改善動(dòng)脈粥樣硬化打破了傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為其是脈管炎專(zhuān)方的看法,通過(guò)觀(guān)察四妙勇安湯對(duì)斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響,為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化、穩(wěn)定動(dòng)脈斑塊進(jìn)一步提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù),以期拓寬臨床的治療思路。

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