陳 浩，袁 鵬，孫 浩，高飛飛，陳 陽，劉 鋅，杜 斌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210012；2.江蘇省中醫(yī)院骨傷科，江蘇南京 210029）

激素性股骨頭壞死（glucoticorticoid-associated osteonecrosis of the femoral head，GA-ONFH）是一種因長期或大劑量應(yīng)用激素導(dǎo)致股骨頭不可逆塌陷、髖關(guān)節(jié)功能障礙的疾?。?］，具有呈漸進(jìn)性發(fā)展、預(yù)后差、致殘率高［2，3］的臨床特點(diǎn)。GA-ONFH 的確切發(fā)病機(jī)制尚無定論，最新研究［4］表明糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）通過誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的凋亡從而降低其增殖，引起細(xì)胞的成骨分化能力減弱、成脂分化增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致骨修復(fù)不足。這也是GA-ONFH 的發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。因此，恢復(fù)BMSCs 成骨和成脂分化之間的平衡對GA-ONFH 的治療至關(guān)重要。

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主骨生髓，腎中所含先天之精是人體生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，對骨骼的強(qiáng)健起主宰作用。長期或大劑量使用GCs 傷及腎精，致五臟六腑失養(yǎng)、氣血生化乏源，血行推動無力而成瘀，髓海瘀滯，髓死骨枯，發(fā)為本病。此類患者的腎上腺皮質(zhì)激素及甲狀腺激素軸被抑制，因此常伴有畏寒、無力、皮膚蒼白、食欲減退等腎陽虛證的臨床表現(xiàn)［5］。右歸飲以“陰中求陽”立法，溫補(bǔ)命門之火，常用于腎陽虧虛之證。多項(xiàng)研究［6］表明，右歸飲能通過調(diào)節(jié)骨代謝發(fā)揮對GA-ONFH 的治療作用。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠BMSCs 進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察右歸飲含藥血清對BMSCs 凋亡相關(guān)蛋白、成骨指標(biāo)的影響，并對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接以明確右歸飲的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)該方治療GA-ONFH 的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD 大鼠20 只，體質(zhì)量200～250 g，6 周齡，購自南京浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0005］，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。該研究經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品及實(shí)驗(yàn)試劑

右歸飲藥物組成：熟地黃30 g，山藥、肉桂、姜杜仲、枸杞子、炙甘草各6 g，山茱萸、制附子各3 g，中藥飲片由江蘇省中醫(yī)院中藥房提供；抗兔Bcl-2（Bcl-2 Rabbit Polyclonal antibody；26593-1-AP）、抗兔Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（BAX Mouse Monoclonal antibody；60267-1-lg）購自Protientech 公司；抗兔半胱氨酸蛋白酶3［Caspase-3（D3R6Y） Rabbit mAb；14220］購自CST 公司；胎牛血清（10091148）、青霉素-鏈霉素（15140122）購自賽默飛世爾科技有限公司；SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂（RASMX-90031）、成骨（RASMX-90021）誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（賽業(yè)生物科技集團(tuán)）；蘇木精、伊紅（四季青公司）；大鼠骨堿性磷酸酶ELISA 試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；茜素紅、油紅O 染液、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜、Percoll（南京碧云天生物有限公司）；P53、LC3Ⅱ抗體、辣根過氧化物酶（Cyagen 公司）。

1.3 主要儀器

倒置相差顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；Image-pro plus 6.0（IPP）；恒溫恒濕孵育箱（Heraeus 公司）；蛋白交互儀（Beckman 公司）；Mini Electrophoresis System 電泳儀（BIO-RAD 公司）；轉(zhuǎn)膜及成像系統(tǒng)（Beckman 公司）；激光共聚焦顯微鏡（ZEISS公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清的制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠平均分為2 組：生理鹽水組、右歸飲組。右歸飲按照灌胃劑量公式［7］：200（mL）÷人類平均體質(zhì)量（kg）×大鼠實(shí)際體質(zhì)量（kg）×倍增系數(shù)，按人類平均體質(zhì)量70 kg，倍增系數(shù)為1 換算后進(jìn)行灌胃，生理鹽水組給予每日8 mL/kg 生理鹽水灌胃，均為1次/d。連續(xù)灌胃2 周，末次灌胃1 h 后脫脊處死，腹主動脈取血，室溫下靜置2 h，離心取上層血清，滅活、過濾、分裝，-80 ℃保存。

1.4.2 細(xì)胞提取與分組 大鼠脊椎脫臼，無菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，剪開干骺端后用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，細(xì)胞過濾器過濾，1 000 r/min 離心8 min，棄上清。加入完全培養(yǎng)基（15% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素+100 μg/mL 鏈霉素、1 mmol/L 的L-谷氨酰胺）吹成細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，2 d 后換液，倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取生長良好的第2 代BMSCs，以4.0×105/mL 培養(yǎng)液種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，根據(jù)文獻(xiàn)報道進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及給藥［8-10］：空白組：10%空白血清；模型組：10% 空白血清+地塞米松5×10-5mol/mL；中藥組：10%含藥血清+地塞米松5×10-5mol/mL；對照組：10%含藥血清。

1.4.3 細(xì)胞增殖情況檢測 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測各組細(xì)胞增殖變化。將BMSCs 接種于4 塊96 孔板中，1 d 后細(xì)胞貼壁取出一塊檢測，之后以2 d 為1 個周期，每天取出一塊96 孔板，吸取培養(yǎng)基，每孔加入10%的CCK8 溶液100 μL，38 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm 檢測吸光度，計(jì)算平均值。繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.4.4 成骨分化指標(biāo)檢測 使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對各組BMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，2 d 后使用骨ALP ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔加各組培養(yǎng)基10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。加入辣根過氧化物酶100 μL，封膜，37 ℃孵育1 h，棄去液體，拍干，洗滌5 次，加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL，ELISA 監(jiān)測儀檢測各孔450 nm 波長的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)量。21 d 后，以茜素紅染色30 min，200 倍鏡下隨機(jī)選取3 個視野，比較各組紅染鈣礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.4.5 Western blot 檢測BMSCs 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組干預(yù)后，待細(xì)胞融合達(dá)90%后進(jìn)行蛋白提取，吸出培養(yǎng)基，PBS 沖洗3 遍，并完全吸干，每孔加入100 μL 細(xì)胞裂解液（1% 苯甲基磺酰氟和10%磷酸酶蛋白酶抑制劑）。15 min 后，用刮板將細(xì)胞刮下，超聲裂解25 s，重復(fù)3 次。細(xì)胞充分裂解后12 000 ×g在4 ℃離心20 min 后取上清，BAC 法測蛋白濃度。加入6×上樣緩沖液混勻后煮沸。電泳板安裝好后制作凝膠，并在上面的樣品孔中加樣。然后在恒壓下進(jìn)行電泳。電泳后，用聚亞乙烯基二氟化物膜0 ℃恒流轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h。之后按條帶剪開，一抗caspase 3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶5 000）在4 ℃下孵化過夜。次日，用TBST 沖洗3次，再用二抗在室溫下孵育1 h，并再次清洗3次。最后，添加顯影液，對條帶進(jìn)行可視化。然后對顯影帶進(jìn)行灰度掃描，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。β-actin作為內(nèi)參，Image J軟件對印跡進(jìn)行定量分析。

1.4.6 分子對接 根據(jù)既往右歸飲質(zhì)譜結(jié)果［11］，對量豐成分進(jìn)行通過Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索，獲得3D 化合物結(jié)構(gòu)，運(yùn)用 Swisstarget（http：//www. swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測其藥代動力學(xué)（ADME），以胃腸吸收率（GI absorption）為High 和類藥性（Drug likeness）＞0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）和RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）查找Bcl-2、Bax、caspase 3的PDB ID，與篩選后的量豐成分前2 位進(jìn)行對接，根據(jù)結(jié)合能評價靶點(diǎn)與活性化合物的結(jié)合強(qiáng)度與活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 形態(tài)學(xué)觀察

48 h 換液后可見BMSCs 貼壁生長，呈紡錘形、橢圓形分布。培養(yǎng)3～7 d 后，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，少量呈三角形集落生長（圖1）。

圖1 BMSCs 鏡下觀察（×200）Fig 1 BMSCs under microscope（×200）

2.2 細(xì)胞增殖結(jié)果

對比各組不同時間點(diǎn)的吸光度（A450）比值，模型組較空白組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而中藥組、對照組較模型組均提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組BMSCs 生長情況（±s）Tab 1 BMSCs growth in each group（±s）

表1 各組BMSCs 生長情況（±s）Tab 1 BMSCs growth in each group（±s）

注：生長情況以各組吸光度（A450）比值表示；與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

7 d 0.97±0.14 0.59±0.10*0.81±0.10#0.96±0.13#27.548＜0.01組別空白組模型組中藥組對照組FP 1 d 1.15±0.13 0.56±0.09*0.97±0.12#1.13±0.14#63.405＜0.01 3 d 1.04±0.16 0.53±0.11*0.88±0.13#1.04±0.12#40.977＜0.01 5 d 1.02±0.11 0.52±0.07*0.78±0.09#1.02±0.12#74.470＜0.01

2.3 成骨誘導(dǎo)結(jié)果

各組BMSCs 成骨誘導(dǎo)2 周后，模型組ALP水平（73.96±3.02）顯著低于空白組（132.32±4.01）和對照組（131.74±3.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相較于模型組，中藥組ALP 水平顯著提高（108.67±4.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后進(jìn)行茜素紅染色標(biāo)定鈣結(jié)節(jié)。模型組與各組相比，紅染鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均顯著降低；對照組與空白組無顯著差異，兩組均高于模型組與中藥組，見圖2。

圖2 各組茜素紅染色情況（×200）Fig 2 Alizarin red staining in each group（×200）

2.4 BMSCs 凋亡蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組促凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase 3 的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平則顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組的Bax 和cleaved caspase 3 的表達(dá)水平較模型組顯著降低，Bcl-2 的表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對照組Bcl-2、Bax 和cleaved caspase 3 的表達(dá)水平與空白組相比無明顯變化，見圖3 及表2。

表2 各組蛋白印跡結(jié)果（±s）Tab 2 Western blot results in each group（±s）

表2 各組蛋白印跡結(jié)果（±s）Tab 2 Western blot results in each group（±s）

注：蛋白印跡定量結(jié)果以各組灰度值與actin 的比值表示；與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

cleaved caspase 3 0.755±0.106 1.846±0.015△0.330±0.104#0.335±0.105#184.823＜0.01組別空白組模型組對照組中藥組FP Bcl-2 1.921±0.438 1.064±0.054△2.458±0.440#2.092±0.007#10.765＜0.01 Bax 0.155±0.022 1.031±0.223△0.321±0.069#0.362±0.113#26.420＜0.01

圖3 各組蛋白表達(dá)Fig 3 The expression of proteins in each group

2.5 分子對接結(jié)果

對量豐成分進(jìn)行篩選后結(jié)果（表3），選取峰值前2 為epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether、delphinin與受體蛋白Bcl-2（PDB 編碼：5vau）、Bax（PDB 編碼：2k7w）、Caspase 3（PDB 編碼：5i9B）進(jìn)行分子對接，結(jié)果見圖4、5，能量越低，分子親和度越好，見表4。

表3 篩選后成分表Tab 3 List of components after screening

表4 分子對接結(jié)合能（kcal/mol）Tab 4 Molecular docking binding energy（kcal/mol）

圖4 Delphinin 與靶點(diǎn)的對接模型Fig 4 Docking model of delphinin and target

圖5 Epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether 與靶點(diǎn)的對接模型Fig 5 Docking model of epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether and target

3 討論

凋亡是指機(jī)體為清除衰老或有害細(xì)胞、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過線粒體凋亡途徑和死亡受體（Fas-FasL）介導(dǎo)途徑，引發(fā)有核細(xì)胞程序性死亡的過程［12］。

作為細(xì)胞死亡通路的整合元件，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色，由線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑被稱為caspase-9 途徑。線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔道復(fù)合物（permeability transition pore composite，PTPC）是一種由外膜蛋白電壓依從性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）、腺嘌呤核苷酸易位體（adenine nucleotide translocase，ANT）、胞溶質(zhì)蛋白D（cyclin D）等組件構(gòu)成［13］的大分子、多蛋白復(fù)合體，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)衰老或有害細(xì)胞時，線粒體內(nèi)膜首先出現(xiàn)滲透性改變（permeability transition，PT），基質(zhì)、胞漿內(nèi)離子藉由PTPC 的開放得以流動，繼而引發(fā)跨膜電位的下降及線粒體外膜的去極化。在dATP/ATP 的協(xié)助下，釋放進(jìn)入胞漿的細(xì)胞色素C 與Apaf-1 結(jié)合、寡聚化，并募集、活化和釋放caspase-9 前體，啟動caspase 級聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-3、caspase-6、caspase-7 等下游分子，最終引起細(xì)胞凋亡［14］。上述途徑也是Bcl-2 蛋白家族調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑。當(dāng)PTPC 開放時，Bcl-2能夠在線粒體外膜形成離子通道，平衡其介導(dǎo)的跨膜離子流動，調(diào)節(jié)線粒體跨膜電位，阻止PTPC 的進(jìn)一步開放，繼而阻斷細(xì)胞凋亡途徑。此外，Bcl-2 還能提高線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止促凋亡蛋白的釋放，對細(xì)胞功能發(fā)揮重要的保護(hù)作用［15］。

基于“腎主骨生髓”理論，右歸飲被廣泛應(yīng)用于腎陽不足導(dǎo)致的骨傷科疾病。全方取“陰中求陽”之義，在肉桂、附子溫腎助陽，補(bǔ)命門之火的同時，以山藥、山萸肉、熟地益腎填精滋陰，使陽得陰助而生化無窮；輔以杜仲、枸杞補(bǔ)益肝腎，甘草調(diào)和諸藥，共奏補(bǔ)腎助陽、壯骨生髓之功。多項(xiàng)研究也證實(shí)了右歸飲具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、平衡成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的形成分化的作用，從而發(fā)揮防治GA-ONFH 的功效。范連霞等［16］使用右歸飲含藥血清體外干預(yù)成骨細(xì)胞，檢測ERK、β-catenin 和Runx-2 的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)右歸飲能通過ERK、Wnt 信號通路顯著增加成骨細(xì)胞活性；吳承亮等［17］發(fā)現(xiàn)右歸飲可抑制股骨頭髓腔內(nèi)骨髓脂肪化，可能通過拮抗GCs 誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)GA-ONFH 的成骨修復(fù)。

Bcl-2 和Bax 的失衡是GCs 誘導(dǎo)BMSCs 凋亡的重要原因［18］。促凋亡蛋白Bax 能與ANT、VDAC 的結(jié)合，促進(jìn)PTPC 的開放［13］，而Bcl-2 可通過與Bax競爭性結(jié)合ANT，或直接阻止Bax 與ANT、VDAC的結(jié)合來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組的Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 表達(dá)增加，右歸飲含藥血清明顯促進(jìn)了經(jīng)GCs 誘導(dǎo)的BMSCs 的增殖，對GCs 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到了保護(hù)作用。此外，相較于模型組，中藥組BMSCs 成骨發(fā)育潛力更強(qiáng)。分子對接結(jié)果表明，右歸飲主要通過epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether、delphinin 等調(diào)控BMSCs 凋亡，促進(jìn)成骨。

綜上所述，右歸飲可能通過調(diào)控GCs 誘導(dǎo)的BMSCs 的凋亡，發(fā)揮對GA-ONFH 的治療作用。但是本次實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了成骨誘導(dǎo)，未行成脂、成軟骨誘導(dǎo)，缺少對間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛力的全面研究；對于凋亡，僅進(jìn)行了蛋白表達(dá)的測定，未進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測等其他實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且其相關(guān)上游通路有待進(jìn)一步探究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

陳浩：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析，論文成文與修改；杜斌：課題項(xiàng)目的總策劃人與總負(fù)責(zé)人，保障課題成功進(jìn)行，論文修改者；劉鋅：協(xié)助通訊作者實(shí)施課題，協(xié)助第一作者進(jìn)行動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作，協(xié)助數(shù)據(jù)處理；袁鵬：協(xié)助動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作，協(xié)助數(shù)據(jù)分析；孫浩：協(xié)助數(shù)據(jù)分析及圖表制作；高飛飛：協(xié)助實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析；陳陽：協(xié)助實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析。