黃巧凡，吳昊霖，徐怡倩，樊好飛，2，方星悅，王愛萍，虞道銳，孟慶雯，劉啟兵，2

（1. 海南醫(yī)學院基礎醫(yī)學與生命科學學院藥理學教研室，海南?？?571199；2. 海南省熱帶腦科學研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南海口 571199）

血管內(nèi)皮細胞具有維持血管張力、參與凝血、調(diào)節(jié)血管通透性等多種生理功能［1］?；钚缘╮eactive nitrogen species，RNS）介導的內(nèi)皮細胞凋亡可導致內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生，可能是動脈粥樣硬化、高血壓、血管炎癥等多種心血管疾病的早期事件之一［2］。內(nèi)皮功能障礙的早期表現(xiàn)之一是線粒體功能和生物發(fā)生的失調(diào)。線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）的不平衡和廣泛形成導致內(nèi)皮功能障礙，這一過程反過來又加速了活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生［3］。最近的報告表明，ROS/RNS 介導的內(nèi)皮細胞損傷與細胞線粒體損傷有關［2，4］。S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是一種細胞RNS 損傷模型藥物，被廣泛用作一氧化氮供體，可引起線粒體的損傷，導致細胞凋亡［5］。目前研究表明，其主要通過介導RNS 的大量釋放進而促進過量ROS 的出現(xiàn)致使細胞凋亡［6］。因此，保護線粒體有助于對抗細胞線粒體中的氧化損傷，維持氧化還原平衡有助于減弱受損進程。葫蘆茶苷（tadehaginoside，THS）是葫蘆茶活性成分之一［7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)THS 在體內(nèi)具有降血糖、抗炎等生物活性［8，9］，但對內(nèi)皮細胞損傷的保護作用研究較少，且作用機制有待闡明。本研究采用高濃度活性氮GSNO（0.5 mmol/L）誘導內(nèi)皮細胞損傷模型，探討THS 對內(nèi)皮細胞線粒體損傷的保護作用，為中草藥葫蘆茶的進一步開發(fā)提供科學依據(jù)。但是THS 如何介導分子信號通路仍然很不清楚。本研究旨在探討GSNO 對內(nèi)皮細胞線粒體的損傷機制以及THS 對內(nèi)皮細胞線粒體基因的潛在益處，為保護血管內(nèi)皮、預防RNS 損傷提供一種潛在保護策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EA.hy 926 細胞系購自中科院上海細胞庫。所有細胞均在37 ℃，含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GSNO（自提，純度≥95%）、THS（自提，純度≥95%）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）和青-鏈霉素（P/S，Gibco）。

1.2 儀器

熒光顯微鏡（Carl Zeiss AG）；全波長酶標儀（Thermo）；離心機（Thermo）；超微量分光光度計（NanoPhotometer）；多功能凝膠成像儀（GE）；實時熒光定量PCR 儀（ABI）。

1.3 方法

1.3.1 Western blot 分析 將EA.hy 926 細胞接種于7 個60 mm 培養(yǎng)皿中，細胞聚合至60%，加入終濃度為0.5 mmol/L GSNO 的DMEM 完全培養(yǎng)基分別損傷0、1、2、4、8、12、24 h，配置RIPA 裂解液（PAPI：PMSF=100∶1），12 000 r/min 離心10 min，通過BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo）進行蛋白定量，用SDS-PAGE 分離各組EA.hy 926 細胞蛋白質(zhì)30 μ L，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5% 脫脂牛奶封閉后，將膜與4 ℃的一抗孵育過夜。樣品洗滌后與二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。本實驗所用抗體如下，anti- BAX（1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）、anti-Bcl-2（1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）、anti-β-actin（1∶5 000，碧云天），用ECL化學發(fā)光試劑盒（碧云天）在多功能成像儀中顯影采集蛋白條帶。

1.3.2 MTT 法檢測THS 細胞毒性 將細胞以105/mL 細胞/孔的密度接種于96 孔板中。分別加入THS 終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的DMEM 完全培養(yǎng)基孵育12 h，每種濃度梯度設3個復孔。

每孔加入20 μL MTT 染料溶液（5 mg/mL），并在37 ℃下孵育4 h。去除上清液，并用150 μL DMSO 溶解底部紫色沉淀。搖床孵育15 min，在490 nm 波長處測定各孔吸光度值。

1.3.3 MTT 法檢測THS 保護作用 分別加入THS 終濃度為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的DMEM 完全培養(yǎng)基37 ℃孵育1 h，然后每孔加入終濃度為0.5 mmol/L GSNO 的DMEM 完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)箱孵育12 h，每種濃度梯度設3 個復孔。MTT 比色方法同1.3.2。

1.3.4 熒光定量PCR 將EA.hy 926 細胞以105/mL 的密度接種于6 孔板中，分組為Control（Con）組、0.5 mmol/L GSNO 組、0.5 mmol/L GSNO+40 μmol/L THS 組，GSNO 組加入0.5 mmol/L GSNO損傷12 h，0.5 mmol/L GSNO+40 μmol/L THS 組先預給藥40 μmol/L THS 1 h 后加入0.5 mmol/L GSNO 損傷EA.hy 926 細胞12 h。采用RNA 提取試劑盒（Thermo）提取各組EA.hy 926 細胞總RNA。紫外分光光度計測定OD 260/OD 280，計算各組總RNA 濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（Thermo）合成cDNA。采用Real-time PCR 檢測目的基因相對表達量，擴增條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s/kb、72 ℃徹底延伸5 min，循環(huán)35 次。在退火步驟中采集熒光信號，每組基因重復3 組。引物序列合成見表1（Sangon Biotech）。

表1 線粒體相關因子引物序列Tab 1 Primer sequence of mitochondrial related factors

1.3.5 JC1 染色檢測線粒體ΔΨm 將EA.hy 926 細胞以105/mL 的密度接種于6 孔板中，分組為Control組、GSNO 組、THS 組，GSNO 組加入0.5 mmol/L GSNO 損傷12 h，THS 組預給藥40 μmol/L THS 1 h 后加入0.5 mmol/L GSNO 損傷EA.hy 926 細胞12 h。按照JC-1 試劑盒（碧云天）流程完成對各組Ea.hy 926 細胞的處理工作，將Ea.hy 926 細胞置于熒光顯微鏡下觀察拍照，紅色為正常線粒體膜電位，綠色代表線粒體膜電位下降。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 GSNO 對EA.hy926 細胞凋亡的影響

圖1 所示，Bcl-2 蛋白隨GSNO 損傷時間的增長逐漸下調(diào)，Bax 蛋白表達趨勢與Bcl-2 蛋白表達相反，說明GSNO 能引起內(nèi)皮細胞凋亡，且隨時間增加不斷加重。但其是否通過損傷線粒體進而引起細胞凋亡仍需進一步研究。

圖1 GSNO 損傷不同時間對EA.hy 926 細胞凋亡蛋白表達的影響Fig 1 The effect of GSNO injury for different length of time on the expression of apoptosis protein in EA.hy 926 cells

2.2 THS 對內(nèi)皮細胞的毒性研究

通過MTT 比色法檢測各組細胞活性，80 μmol/L 與160 μmol/L THS 組細胞存活率分別為90.77% 和85.24%，與0 μmol/L THS 組相比略微下降，差異均無統(tǒng)計學意義（t=1.083，P=0.339 8；t=1.911，P=0.128 6）。5、10、20、40 μmol/L THS組細胞活性分別為102.04%、103.81%、106.03%和99.32%，與0 μmol/L THS 組相似，差異均無統(tǒng)計學意義，見圖2。結(jié)果表明5～160 μmol/L 的THS 對細胞存活無影響，認為無細胞毒性。

圖2 不同濃度THS 對EA.hy926 細胞存活率的影響Fig 2 The effect of different concentrations of THS on the survival rate of EA.hy 926 cells

2.3 THS 的最佳藥物保護濃度

不同濃度THS 預給藥1 h 后加入高濃度GSNO 損傷內(nèi)皮細胞，圖3 MTT 結(jié)果表明，5 μmol/L THS 對細胞內(nèi)皮損傷的保護能力較弱（74.38%，t=2.716，P=0.053 2），10～160 μmol/L THS 均有明顯的保護作用（87.2%，t=9.782，P=0.000 6；101.6%，t=43.36，P＜0.000 1；110.2%，t=13.6，P=0.000 2；88.8%，t=5.377，P=0.005 8；86.1%，t=12.95，P=0.000 2），其中40 μmol/L THS 對內(nèi)皮細胞的保護能力最強（110.2%，t= 49.12，P＜0.01），且細胞毒性實驗表明40 μmol/L THS（99.32%，t=13.6，P＜0.01）無細胞毒性，因此本實驗選用40 μmol/LTHS 進行后續(xù)實驗，研究其對GSNO 損傷內(nèi)皮細胞線粒體的保護作用。

圖3 THS 對GSNO 誘導的內(nèi)皮細胞損傷后的保護作用Fig 3 The protective effect of THS on endothelial cell in?jury induced by GSNO

2.4 THS 對線粒體相關基因表達的影響

2.4.1ND-1與COX-1基因表達量 采用2-△△Ct法計算基因相對表達量，圖4 結(jié)果顯示：與Con 組比較，0.5 mmol/L GSNO 損傷內(nèi)皮細胞后，ND-1的表達量顯著增加（2-△△Ct=1.98，t=49.94，P＜0.01），但COX-1基因表達量明顯減少（2-△△Ct=0.80，t=10.37，P＜0.05），說明GSNO 可能損傷內(nèi)皮細胞線粒體基因。與0.5 mmol/L GSNO 組相比，THS 明顯抑制了ND-1的表達（2-△△Ct=1.20，t=49.94，P＜0.01），并增加了COX-1的表達（2-△△Ct=0.94，t=5.461，P＜0.01）。

圖4 THS 對GSNO 損傷EA.hy926 細胞12 h 后ND?1 和COX?1 基因表達的影響Fig 4 The effect of THS on the expression of ND-1 and COX-1 genes after GSNO injuried EA.hy926 cells for 12 hours

2.4.2IL-1β基因表達量 圖5 所示，與Con 組相比，0.5 mmol/L GSNO 能顯著上調(diào)IL-1β基因表達量（2-△△Ct=22.94，t=34.49，P＜0.01）。與0.5 mmol/L GSNO 組比較，GSNO+40 μmol/L THS 顯著抑制IL-1β基因表達（2-△△Ct=1.26，t=33.86，P＜0.01），說明THS 有明顯的抗炎作用。

圖5 THS 對GSNO 損傷EA.hy926 細胞12 h 后IL?1β 基因表達的影響Fig 5 The effect of THS on IL-1β gene expression after GSNO injury in EA.hy926 cells for 12 hours

2.5 JC-1 線粒體膜電位變化

圖6 所示，通過JC-1 試劑盒（碧云天）檢測線粒體膜電位，正常的EA.hy926 細胞（Control 組）線粒體呈紅色熒光；當線粒體膜電位下降后，紅色熒光強度顯著降低，而細胞漿中的綠色熒光顯著增強（GSNO 組）。THS 干預后明顯恢復內(nèi)皮細胞紅色熒光，降低了綠色熒光，說明THS 具有保護線粒體膜電位的作用。

圖6 THS 對GSNO 損傷EA.hy 926 細胞線粒體膜電位變化的影響Fig 6 The change of mitochondrial membrane potential of EA.hy 926 cells 12 h after THS damages GSNO

3 討論

ROS 和RNS 是細胞具有重要意義的代謝物［10］。相對低濃度下，它們在調(diào)節(jié)機體生理過程方面發(fā)揮多方面作用，但高濃度一氧化氮會產(chǎn)生高N2O3和ONOO-水平［11］。據(jù)報道，過量的N2O3和ONOO-可形成大量NO2和OH-自由基，并可能加劇蛋白質(zhì)、脂類和DNA 的不可逆亞硝化和亞硝酰化［12］。有文獻報道了ROS 和RNS 的過量產(chǎn)生是內(nèi)皮功能障礙的特征之一［13］。同時也有研究顯示，大量的RNS 可能引起細胞供能系統(tǒng)線粒體損傷和ROS 的大量釋放［14］。

線粒體對于維持多種生理功能至關重要，mtROS 在細胞信號轉(zhuǎn)導和維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用。然而，過多的mtROS 產(chǎn)生會導致細胞氧化應激狀態(tài)，這是線粒體功能障礙的標志之一，同時可能直接或間接通過氧化應激誘發(fā)血管功能破壞［15］。本實驗通過高濃度GSNO（0.5 mmol/L）對內(nèi)皮細胞系EA.hy 926 模擬高濃度RNS 損傷細胞模型，通過Western Blot 法檢測GSNO 損傷不同時間凋亡相關蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)GSNO 對凋亡蛋白Bax 的損傷呈時間依賴性增高，抗凋亡蛋白Bcl-2 則顯示出與之相反的趨勢，可以看出GSNO 作用于內(nèi)皮細胞后，細胞隨時間凋亡逐漸加劇。此外，MTT法驗證了5～160 μmol/L THS 沒有明顯的細胞毒性，同時預給藥THS 1 h 后給予高濃度GSNO 損傷內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)10～160 μmol/L 的THS 均對損傷后細胞有明顯的保護作用，其中40 μmol/L THS 保護作用最明顯，因此，本實驗選用40 μmol/L THS保護內(nèi)皮細胞驗證其對內(nèi)皮細胞線粒體損傷的保護作用。

線粒體是細胞ROS 的重要來源，實驗和疾病模型的數(shù)據(jù)表明，過量的mtROS 在調(diào)節(jié)血管功能障礙中發(fā)揮著關鍵作用［16］。有人提出，COX-1的損傷導致ROS 中間體促進線粒體氧化應激活化凋亡信號通路［17-19］。線粒體ND-1基因是參與線粒體氧化磷酸化電子傳遞鏈的第一步，通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP［20］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度GSNO 損傷后COX-1表達量明顯下降，同時ND-1出現(xiàn)明顯增多，說明高濃度GSNO 可能通過損傷線粒體DNA 促進內(nèi)皮細胞凋亡。和0.5 mmol/L GSNO 組比較，THS 能明顯抑制ND-1和IL-1β基因表達，上調(diào)COX-1基因表達。Liu 等［2］研究發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位的降低可能協(xié)同增加線粒體ROS 的釋放，同時促進GSNO 次級反應性介質(zhì)過氧亞硝酸鹽的形成，進而加重線粒體的損傷。本研究采用JC-1 法發(fā)現(xiàn)GSNO 能明顯降低線粒體膜電位，而THS 一定程度上恢復了線粒體膜電位，說明THS 對內(nèi)皮細胞線粒體損傷具有一定的保護作用。

研究表明，線粒體功能障礙可能加重內(nèi)皮功能障礙，導致炎癥被激活［16］。同時也有研究表明，Bcl-2 和BAX 的激活不僅能導致COX 的釋放，還導致了線粒體DNA（mtDNA）的釋放，進而調(diào)節(jié)炎癥反應［21］。因此筆者還檢測了IL-1β基因的表達，發(fā)現(xiàn)其在高濃度GSNO 損傷下大量生成，說明內(nèi)皮細胞線粒體存在炎癥反應。

綜上所述，GSNO 可能通過引起線粒體功能障礙，進而引發(fā)炎癥因子大量釋放并促進內(nèi)皮細胞凋亡。同時，THS 在一定程度上保護內(nèi)皮細胞免受高濃度GSNO 的損傷，保護血管內(nèi)皮細胞線粒體損傷在防治心血管疾病中具有重要意義，其機制可能與上調(diào)線粒體關鍵基因COX-1，下調(diào)ND-1基因有關。但研究發(fā)現(xiàn)其對IL-1β的抑制效果更顯著，可能還通過其他途徑抑制炎癥因子保護內(nèi)皮細胞的損傷作用，因此需要更進一步研究其潛在保護機制。

作者貢獻度說明：

黃巧凡，吳昊霖：參與實驗，撰寫論文；徐怡倩：參與實驗，整理數(shù)據(jù)；樊好飛：指導實驗，參與實驗；方星悅：參與實驗，購買耗材；王愛萍：參與實驗，整理數(shù)據(jù)；虞道銳：參與實驗，提供實驗器材；孟慶雯：參與實驗，整理數(shù)據(jù)；劉啟兵：指導實驗，參與實驗，修改論文。