戰(zhàn)晶玉，袁星星，王炳予，劉長發(fā)，張雅麗

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江哈爾濱 150036）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以直結(jié)腸黏膜及黏膜下層彌漫性、連續(xù)性炎癥改變?yōu)橹饕卣鞯姆翘禺愋缘难装Y性腸病［1］。近幾十年來，隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程，UC 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢［2］。作為炎癥性腸病的常見類型之一，UC 好發(fā)于乙狀結(jié)腸及直腸部位，通常以腹瀉、腹痛和黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)，并呈現(xiàn)發(fā)作-緩解反復(fù)交替的特征［3］。不僅如此，UC 患者總體癌變率為3.7%，約占UC 死亡原因的15%，從UC-腸癌的發(fā)病呈現(xiàn)“炎癥—不典型增生—癌變”的模式［4］。因此有效抑制腸道黏膜炎癥是治療UC 和預(yù)防結(jié)直腸癌的重要途徑。

連草瀉痢膠囊是張雅麗教授治療UC 的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、滲濕排膿、行氣止痛的功效。前期的研究結(jié)果表明，連草瀉痢膠囊能夠顯著改善腸道黏膜屏障功能和降低炎癥因子IL-17 和TNF-α 的水平，對于大腸濕熱證UC 具有較好的臨床療效［5］。因此，本研究通過觀察連草瀉痢膠囊對UC 小鼠模型腸道黏膜炎癥因子及toll 樣受體4/磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo)（TLR4/PI3K/Akt/mTOR）TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響，以期進(jìn)一步明確其治療UC 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級C57BL/6N 小鼠（雄性，8～10 周齡），體質(zhì)量約20～26 g，購于北京Charles River 公司（實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011）。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件：溫度：21～24℃，濕度：44%～55%，自由飲水及攝食，同時給予循環(huán)光照。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行［6］。

1.2 藥物與試劑

連草瀉痢膠囊（0.5 g/粒，黑藥制字：Z20180005）購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院成藥局；美沙拉嗪腸溶片（美莎欣，800 mg/片，國藥準(zhǔn)字：H20103359）購于黑龍江天宏藥業(yè)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購于MP Biomedicals 公司；TLR4、PI3K、Akt、p-Akt（Thr308）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）及β-actin 兔單抗購于美國Cell Signaling Technology 公司；山羊抗兔IgG 二抗購于美國Abcam 公司；Western Blot ECL 化學(xué)發(fā)光液購于美國Millipore 公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-8（IL-8）、白介素-17（IL-17）和γ-干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（ELISA）購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購于北京Solarbio 公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備 造模開始前取3 g DSS 溶于蒸餾水100 mL 中配置成終濃度為3%的DSS 溶液；同時分別取適量連草瀉痢膠囊和粉碎后的美沙拉嗪腸溶片溶于蒸餾水500 mL 配置成16.1 g/L 和15.6 g/L 的混懸液。

1.3.2 分組與動物造模 小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、連草瀉痢組和美沙拉嗪組，每組10 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后參照文獻(xiàn)中方法進(jìn)行造模［7］：除空白組外，余下3 組小鼠給予3%DSS 溶液自由飲用，空白組小鼠予以自由飲水，每日記錄各小鼠飲水量并補(bǔ)充新鮮DSS 溶液，連續(xù)7 d。造模期間，各組給予相應(yīng)的藥物治療（參照人和動物藥物等效劑量進(jìn)行換算），其中連草瀉痢組給予0.77 g/kg 連草瀉痢水溶液灌胃，美沙拉嗪組給予0.68 g/kg 美沙拉嗪混懸液進(jìn)行灌胃，而空白組和模型組小鼠則給予等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1 次，每次1 mL，連續(xù)7 d。各組小鼠末次給藥后24 h，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉后眼球取血，采血后以1%戊巴比妥鈉800 mg/kg 腹腔注射處死小鼠后分離結(jié)腸組織，并測定各組小鼠結(jié)腸長度。隨后取1 cm 中段結(jié)腸組織以磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗干凈后置于4%多聚甲醛中的固定，余下組織置于-80℃保存。

1.3.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 取固定于4%多聚甲醛中的結(jié)腸組織，梯度乙醇脫水后置于二甲苯中進(jìn)行透明處理，石蠟包埋后以中性樹脂進(jìn)行封片，置于切片機(jī)上進(jìn)行切片，切片厚度設(shè)定為4 μm。參照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)的改變，并參照文獻(xiàn)中評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評分［8］。

1.3.4 EILSA 檢測 取適量結(jié)腸組織并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液中沖洗，玻璃勻漿器于冰浴中充分勻漿。于4 ℃環(huán)境下3 500 r/min 離心10 min，取上清。此外，取眼球血，靜置后4 ℃環(huán)境下3 500 r/min 離心10 min，取上清。參照ELISA 試劑盒說明書測定組織及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17、INF-γ 的含量。

1.3.5 Western blot 檢測 取適量結(jié)腸組織剪碎，加裂解液冰上裂解，離心取上清，以BCA 法測定總蛋白濃度；加入15 μL 蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入稀釋后的TLR4、PI3K、Akt、p-Akt（Thr308） 、mTOR、p-mTOR（Ser2448）及β-actin 兔單抗（1∶1 000），4 ℃條件孵育過夜；TBST 緩沖液洗膜5 次，加入適量稀釋后的山羊抗兔后室溫下繼續(xù)孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜5 次。滴加ECL 顯影液，凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算目的蛋白條帶的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示。多組間數(shù)據(jù)的比較以單因素方差（ANOVA）進(jìn)行分析，組間兩兩的比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連草瀉痢膠囊對小鼠結(jié)腸長度的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，模型組小鼠死亡2 只，連草瀉痢組和美沙拉嗪組小鼠各死亡1 只。模型組結(jié)腸長度較空白組明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，連草瀉痢膠囊和美沙拉嗪均能明顯增加UC 小鼠結(jié)腸長度，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 連草瀉痢膠囊對小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)的影響

空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組小鼠結(jié)腸組織中可見局部潰瘍、糜爛，黏膜下層可見大量的炎性細(xì)胞存在及肉芽組織形成，其中組織病理學(xué)評分與空白組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。連草瀉痢膠囊及美沙拉嗪均能夠顯著改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞的浸潤，尤其是組織水腫和黏膜潰瘍、糜爛明顯得到改善。兩組組織病理學(xué)評分與模型組比較均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1 和表1。

表1 連草瀉痢膠囊對小鼠結(jié)腸長度的影響（±s）Tab 1 Effect of Liancao Xieli capsule on colon length in mice（±s）

表1 連草瀉痢膠囊對小鼠結(jié)腸長度的影響（±s）Tab 1 Effect of Liancao Xieli capsule on colon length in mice（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組織學(xué)評分（分）0.20±0.42 3.25±0.71**1.44±0.73##1.56±0.53##38.278 0.000組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組n 10 899 FP結(jié)腸長度（cm）9.21±1.42 6.64±1.12**8.20±1.09#8.19±1.03#7.539 0.001

圖1 各組小鼠結(jié)腸HE 染色（×400）Fig 1 HE staining of colon of mice in each group（×400）

2.3 連草瀉痢膠囊對血清及結(jié)腸組織炎癥因子的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組血清及結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 的含量均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，連草瀉痢組和美沙拉嗪組血清及結(jié)腸組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 的含量均明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2、3。

表2 連草瀉痢膠囊對血清炎癥因子的影響（pg/mL，±s）Tab 2 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mL，±s）

表2 連草瀉痢膠囊對血清炎癥因子的影響（pg/mL，±s）Tab 2 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組INF-γ 1.20±0.05 2.57±0.30**1.66±0.14##1.68±0.16##90.012 0.000 n 10 899 FP TNF-α 0.17±0.06 0.28±0.06**0.21±0.04##0.22±0.04##7.140 0.001 IL-6 34.01±3.20 62.70±6.71**46.72±6.21##46.56±5.70##39.969 0.000 IL-1β 3.17±0.24 12.30±1.89**5.98±0.51##5.96±1.03##113.983 0.000 IL-8 10.12±2.59 32.36±3.29**16.76±2.20##17.12±2.89##100.810 0.000 IL-17 18.91±2.14 50.05±3.00**31.60±2.10##30.84±2.30##254.541 0.000

表3 連草瀉痢膠囊對結(jié)腸組織中炎癥因子的影響（pg/mg，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mg，±s）

表3 連草瀉痢膠囊對結(jié)腸組織中炎癥因子的影響（pg/mg，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mg，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組INF-γ 0.99±0.04 2.46±0.37**1.34±0.20##1.45±0.35##47.925 0.000 n 10 899 FP TNF-α 0.12±0.03 0.23±0.03**0.16±0.06##0.22±0.04##8.717 0.000 IL-6 21.26±2.00 63.51±3.59**35.55±4.12##37.11±1.91##295.585 0.000 IL-1β 1.22±0.14 10.63±2.01**4.37±0.63##4.45±0.58##124.447 0.000 IL-8 7.17±0.86 25.10±4.89**18.10±3.74##19.06±2.28##50.115 0.000 IL-17 13.73±2.92 44.52±12.43**29.03±4.33##30.71±5.27##29.816 0.000

2.4 連草瀉痢膠囊對TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響

由圖2 可見，與空白組相比，模型組結(jié)腸組織中TLR4、PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Akt和mTOR 蛋白的表達(dá)水平無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，連草瀉痢組和美沙拉嗪組結(jié)腸組織中TLR4、PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而連草瀉痢膠囊及美沙拉嗪對結(jié)腸組織中Akt 和mTOR 蛋白的的表達(dá)水平無明顯影響，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of TLR4 /PI3K /Akt/mTOR signal pathway related proteins in colon tissues of mice in each group

表4 連草瀉痢膠囊對TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響（pg/mg，±s）Tab 4 Effect of Liancao Xieli Capsule on TLR4/PI3K/Akt/mTOR signal pathway（pg/mg，±s）

表4 連草瀉痢膠囊對TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響（pg/mg，±s）Tab 4 Effect of Liancao Xieli Capsule on TLR4/PI3K/Akt/mTOR signal pathway（pg/mg，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

p-mTOR/ mTOR 0.35±0.08 0.64±0.13**0.40±0.11##0.43±0.09##13.382 0.000組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組n 10 899 FP TLR4/β-actin 0.22±0.03 0.74±0.12**0.41±0.18##0.42±0.18##20.448 0.000 PI3K/β-actin 0.12±0.03 0.47±0.09**0.27±0.06##0.29±0.04##56.318 0.000 p-Akt/Akt 0.35±0.17 0.68±0.19**0.42±0.17##0.48±0.15##5.973 0.002

3 結(jié)論

UC 的發(fā)病是由多種因素共同參與的結(jié)果，主要包括飲食環(huán)境因素、心理因素及遺傳易感性等。有研究顯示，蛋奶制品和高動物脂肪飲食能夠增加UC 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，這可能是因?yàn)榈澳讨破泛透邉游镏撅嬍衬軌驅(qū)δc道菌群及腸道免疫產(chǎn)生影響，從而損傷腸道黏膜屏障［9］。此外根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，UC 的發(fā)病因地域而異，表現(xiàn)為歐美地區(qū)高，亞非地區(qū)低發(fā)病率，農(nóng)村低于城市的特點(diǎn)［10］。除此之外，UC 還具有復(fù)雜的病理機(jī)制，目前尚未完全闡明。目前的研究普遍認(rèn)為腸道黏膜屏障功能受損出現(xiàn)在UC 發(fā)病的早期，進(jìn)而導(dǎo)致腸道黏膜上皮通透性的改變誘導(dǎo)腸道神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂［11］。此外，一旦結(jié)腸黏膜的完整性和功能受到破壞，來源于腸道內(nèi)的病原菌及其代謝產(chǎn)物通過侵入結(jié)腸黏膜，加重或誘發(fā)腸道局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致UC 的形成［12］。

炎癥反應(yīng)是UC 病理機(jī)制的核心，而細(xì)胞因子作為炎癥介質(zhì)調(diào)控腸道黏膜的病理性損傷，在UC的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用［13］。TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 是重要的促炎因子，介導(dǎo)UC 的發(fā)病。TNF-α 由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、分化和募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)腸道黏膜的局部炎癥。不僅如此，TNF-α 還可以促進(jìn)IL-1 和IL-6 的分泌，并與之協(xié)同作用，參與細(xì)胞的炎癥和凋亡［14］。IL-8 是由TNF-α 和IL-6 促進(jìn)生成的炎性細(xì)胞因子，通過對嗜堿性粒細(xì)胞及T細(xì)胞的趨化作用和促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附與活化，參與腸道炎癥反應(yīng)［15］。同時，臨床研究顯示UC 患者TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-8 的水平增加，并且與UC 的疾病活動指數(shù)呈明顯正相關(guān)［16］。IL-17 主要由輔助性T 細(xì)胞17 分泌，不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分析IL-6 和IL-8 等炎癥因子，還可以通過增加腸道黏膜的通透性并募集中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)UC 腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，引起腹瀉和黏液膿血便的發(fā)生［17］。

TLR4 是TLRs 家族的一員，通過識別病原體表面的相關(guān)分子模式誘導(dǎo)下游信號通路的活化，從而激活炎癥因襲的表達(dá)，誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)［18］。TLR4 信號是促炎細(xì)胞因子釋放的主要通路之一，通過激活下游PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化，參與UC 腸道炎癥反應(yīng)和癌變過程［19-21］。PI3K 是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的激酶，激活后的PI3K 通過質(zhì)膜上產(chǎn)生的第二信使磷脂酰肌醇三磷酸與細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié)構(gòu)域的信號蛋白Akt 結(jié)合，從Akt 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并改變其構(gòu)象。作為Akt 下游重要的效應(yīng)分子之一，Akt 的活化常伴隨著m TOR 的磷酸化，而mTOR 的活化對于細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)方面具有重要的作用［22］。課題組前期的研究結(jié)果顯示，連草瀉痢膠囊能夠有效改善UC 腸道黏膜屏障功能。在此基礎(chǔ)上本研究結(jié)果顯示，連草瀉痢膠囊可以抑制UC 小鼠腸組織中TLR4 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化，從而減少炎癥因子的分泌和腸道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，連草瀉痢膠囊可以有效改善UC 腸道炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制主要是通過抑制TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化實(shí)現(xiàn)的。

作者貢獻(xiàn)度說明：

戰(zhàn)晶玉：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，指標(biāo)檢測，撰寫論文；袁星星、王炳予：實(shí)驗(yàn)造模、藥物干預(yù)；劉長發(fā)：指標(biāo)檢測；張雅麗：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)審核及統(tǒng)計(jì)分析，審閱。