孔德穎，蔡燕飛

（1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642）

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通過(guò)β-1，4-糖苷鍵組成的同聚物，是海洋中含量最豐富的生物大分子之一[1]。導(dǎo)致珊瑚白化的溶珊瑚弧菌Vibrio coralliilyticus[2]隸屬于細(xì)菌變形菌門(mén)Proteobacteria，丙型變形菌綱Gammaproteobacteria，弧菌目Vibrionales，弧菌科Vibrionaceae，是珊瑚蟲(chóng)重要病原微生物之一，其所在的弧菌屬Vibrio 具有強(qiáng)大幾丁質(zhì)降解能力，除珊瑚蟲(chóng)外，溶珊瑚弧菌還是魚(yú)類(lèi)和軟體動(dòng)物的病原菌[3]，威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展。幾丁質(zhì)酶[4]在溶珊瑚弧菌生活史中發(fā)揮重要作用，弧菌依附在寄主表面外骨骼上，獲取碳源的第一步為幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)降解為N-乙酰氨基葡萄糖二聚～六聚物（GlcNAc）2～6，進(jìn)而從細(xì)胞外周質(zhì)空間通過(guò)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。陸生微生物幾丁質(zhì)酶大多由GH18 和GH19 兩種糖苷水解酶組成，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

重組蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的過(guò)程中，緩沖液的離子濃度通常為200～500 mmol·L-1甚至更高，因此具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的酶制劑需要經(jīng)脫鹽工藝處理[5]。然而，溶珊瑚弧菌的幾丁質(zhì)酶具有酶活高，還有適應(yīng)海洋高鹽環(huán)境特點(diǎn)，理論上為保證最大酶活，反而需要保留較高的鹽離子濃度，使其相比源自于陸生生物的酶制劑更具成本優(yōu)勢(shì)[6]。

本研究選擇了1 株分離自海洋的溶珊瑚弧菌，其幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行序列改造和大腸桿菌重組表達(dá)、純化，摸索出一套簡(jiǎn)單易行的純化工藝，同時(shí)對(duì)其酶活特性進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)重組幾丁質(zhì)酶具有較好生物防治潛力。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

基因組提取試劑盒、DNA 回收純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，BamHI、HindIII 酶、T4 DNA ligase購(gòu)自Thermo Scientific，pET30a 購(gòu)自大連寶生物有限公司，其他試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純；超凈工作臺(tái)（ZHJHC1115C）、恒溫振蕩培養(yǎng)器（ZHWY-211B）、恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9082）采用上海智城公司的產(chǎn)品，臺(tái)式離心機(jī)（5417R）采用Eppendorf 公司的產(chǎn)品。

1.2 幾丁質(zhì)酶序列改造

在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找溶珊瑚弧菌幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列（WP_045985309.1）。采用胞內(nèi)原核表達(dá)策略，經(jīng)序列分析，刪減信號(hào)肽區(qū)域（1M～20A），保留GH18 家族幾丁質(zhì)酶保守域（69I～495D）和幾丁質(zhì)酶C 的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守域（461K～495D），同時(shí)為增加幾丁質(zhì)結(jié)合能力，在N 端額外增加1 個(gè)陸生真菌幾丁質(zhì)結(jié)合域（XP_014082242，CSEFGFCGTTADFCGKNCQS），為保證各保守域功能獨(dú)立，用柔性肽（GSGSGS）進(jìn)行區(qū)隔。將改造后的幾丁質(zhì)酶命名為VcChit56，經(jīng)大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化，提交至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.3 VcChit56 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

將VcChit56 基因和pET30a 原核表達(dá)載體同時(shí)用BamHI 和HindIII 酶切（37 ℃，30 min），然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并用T4 DNA ligase 連接膠回收后的VcChit56 基因片段和pET30a 質(zhì)粒骨架。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3），挑選3 個(gè)陽(yáng)性單克隆菌株，送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

將測(cè)序正確的表達(dá)菌株接種于50 mL 含50 ng·mL-1卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，37 ℃，220 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100 體積比擴(kuò)培至OD600=0.5 時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h，收集菌體，用1× PBS 沖洗2 次，凍存于-80 ℃。

1.4 VcChit56 層析純化

將菌體重懸于4 ℃預(yù)冷的Buffer A 緩沖液中（50 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，200 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1PMSF，pH 8.0），高壓均質(zhì)儀破碎，12 000 r·min-1，4 ℃離心30 min。將離心收集的上清用AKTA pure100 層析儀（Cytiva，瑞典）上樣于Ni-NTA 層析柱，用Wash Buffer（50 mmol·L-1Tris-HCl，40 mmol·L-1咪唑，200 mmol·L-1NaCl，pH 8.0）沖洗4 個(gè)柱體積（20 mL），后用Elution buffer（50 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1咪唑，200 mmol·L-1NaCl，pH 8.0）接入層析儀pump B，按照1 mL·min-1流速，20 min 內(nèi)到100%pump B 進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫峰，用10 kd 超濾管進(jìn)行濃縮處理，保存于5% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液，同時(shí)對(duì)各個(gè)組分留樣進(jìn)行SDS PAGE 凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 不同鹽離子濃度下VcChit56 酶活分析

配制酶活測(cè)定體系如下：100 μL 純化后的幾丁質(zhì)酶（1 μg·μL-1），200 μL 2%膠體幾丁質(zhì)，300 μL PBS 緩沖液（pH=7.8）或300 μL PBS+NaCl 緩沖液（PBS 1×，pH=7.8，氯化鈉濃度分別為100，200，300，400，500，600，700，800 mmol·L-1），37 ℃反應(yīng)1 h 后用3,5-二硝基水楊酸（DNS）終止反應(yīng)，沸水孵育10 min，后測(cè)定540 nm 吸光值。同時(shí)以商品純幾丁質(zhì)酶作為對(duì)照組。酶活單位定義：?jiǎn)挝粫r(shí)間（min）從膠體幾丁質(zhì)釋放1 μmol GlcNAc 所需酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 VcChit56 氨基酸序列分析

幾丁質(zhì)酶家族前20 個(gè)左右氨基酸為信號(hào)肽區(qū)，負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)酶向胞外分泌[7]，本研究通過(guò)SignalP-5.0分析可知，氨基酸序列WP_045985309.1 的原始序列信號(hào)肽分值0.66（圖1），與其細(xì)胞周質(zhì)降解幾丁質(zhì)功能的亞細(xì)胞定位吻合。氨基酸序列WP_045985309.1 的REJ 保守域位于569T～845E，預(yù)測(cè)含有多個(gè)細(xì)分亞結(jié)構(gòu)域，但因具體功能未知，這部分序列在本研究與信號(hào)肽序列一并刪除。為了增強(qiáng)幾丁質(zhì)結(jié)合能力，參考許穎等[8]、李大琪等[9]、鐘萬(wàn)芳等[10]的研究，本研究在VcChit56 的N 端額外增加陸生真菌來(lái)源幾丁質(zhì)結(jié)合保守域（land fungi chitin bind region，LFCh BD：CSEFGFCGTTADFCGKNCQS），同時(shí)保留C 端野生ChiC BD保守域（PAWDSSAQYPDSGTLVSHNGFVWQNQWYANVGEEPGVADVWEL）（圖2，圖3）。此外，為防止鄰近幾丁質(zhì)結(jié)合保守域之間的空間位阻，參考甘中偉等[11]、魏巍等[12]的研究，在各保守域之間增設(shè)柔性氨基酸鏈GSGSGS（圖2，圖3）。

圖1 XP_014082242 序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of signal peptide of sequence XP_014082242

圖2 VcChit56 序列示意圖Fig.2 Sequence schematic diagram of VcChit56

圖3 VcChit56 序列與溶珊瑚弧菌幾丁質(zhì)酶以及陸生真菌幾丁質(zhì)酶序列同源性比對(duì)Fig.3 Homology comparison of CH18,ChiC BD and LFCh BD

經(jīng)過(guò)以上精細(xì)設(shè)計(jì)，VcChit56 重組蛋白共由508 個(gè)氨基酸組成，與降解幾丁質(zhì)相關(guān)的功能域從N 端到C 端依次為，①陸生真菌幾丁質(zhì)酶結(jié)合域、②GH18 糖苷水解酶、③弧菌幾丁質(zhì)結(jié)合域。兩個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域可有效增加底物結(jié)合效率，另外功能域之間由柔性氨基酸分隔，可降低功能域錯(cuò)誤折疊和空間位阻的概率。

2.2 VcChit56 原核表達(dá)與純化

測(cè)序正確的重組表達(dá)菌株經(jīng)過(guò)1 mmol·L-1IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h 后，樣品經(jīng)過(guò)組氨酸-鎳離子親和層析和SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示6xHis 標(biāo)簽?zāi)康牡鞍自?00 mmol·L-1咪唑濃度下開(kāi)始洗脫，200 mmol·L-1咪唑濃度下蛋白洗脫效率達(dá)到最高，該結(jié)果與范艷華[13]的研究結(jié)果一致。在約56 kD 位置出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)表達(dá)條帶（圖4），與預(yù)測(cè)分子量55.81 kD 一致。細(xì)菌菌體裂解后，蛋白條帶豐度增加，顯示有更多蛋白內(nèi)含物析出，結(jié)果與莊群等[14]的研究結(jié)果類(lèi)似。菌體裂解液離心后，沉淀組分蛋白含量低，切除與目的條帶一致的蛋白，說(shuō)明本研究對(duì)蛋白序列結(jié)構(gòu)改造并未造成包涵體現(xiàn)象，目標(biāo)蛋白溶解度高。此外，鎳柱流穿組分和洗雜組分無(wú)VcChit56 條帶，所有目的蛋白都被有效結(jié)合，無(wú)純化損失（圖5）。

圖4 VcChit56 SDS-PAGE 層析純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE purification results of VcChit56

圖5 VcChit56 SDS-PAGE 分析結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis results of VcChit56

重組蛋白正確折疊對(duì)減少包涵體生成至關(guān)重要，本研究結(jié)果進(jìn)一步預(yù)示VcChit56 序列的合理性。在接下來(lái)工作中，可開(kāi)展蛋白結(jié)構(gòu)解析，并利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)指導(dǎo)VcChit56 序列進(jìn)一步優(yōu)化和功能迭代升級(jí)。

2.3 VcChit56 酶活分析

本研究以2%膠態(tài)幾丁質(zhì)為底物，重點(diǎn)分析商品幾丁質(zhì)酶和弧菌幾丁質(zhì)酶在不同鹽離子濃度下的酶活特性。由圖6 所示，VcChit56 的酶活整體高于商品幾丁質(zhì)酶，該結(jié)果與連文浩[15]的研究結(jié)果一致。此外，2 種幾丁質(zhì)酶的鹽離子適應(yīng)性差異顯著（P＜0.05），商品幾丁質(zhì)酶的最適酶活發(fā)生于較低鹽離子濃度，例如100 mmol·L-1NaCl 和1× PBS，而VcChit56 的最高酶活為1.89，發(fā)生于高鹽離子濃度（500～600 mmol·L-1），與海水的鹽離子濃度接近，與該幾丁質(zhì)酶來(lái)源于生活在海洋中的溶珊瑚弧菌有關(guān)。隨著鹽離子濃度增加到一定程度，2 種酶的酶活都呈下降趨勢(shì)，但2 個(gè)閾值有明顯差異：商品化幾丁質(zhì)酶鹽離子濃度閾值在100～200 mmol·L-1，VcChit56 鹽離子濃度閾值在700 mmol·L-1以上。最后，從圖6 中可知，VcChit56 與商品幾丁質(zhì)酶在各個(gè)鹽離子濃度下酶活相比差異顯著，該結(jié)果與宋柳[16]的研究結(jié)果類(lèi)似，同時(shí)也說(shuō)明，具有生物活性的幾丁質(zhì)酶更適應(yīng)高鹽離子濃度的環(huán)境。

圖6 不同鹽離子濃度下商品幾丁質(zhì)酶和VcChit56 酶活測(cè)定Fig.6 Determination of commercial chitinase and VcChit56 enzyme activity under different salt ion concentration

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大量使用飼料、肥料、藥物，在利用其活性成分同時(shí)，這些添加物也會(huì)造成水環(huán)境滲透壓和鹽離子濃度升高，這可能是未經(jīng)改造的天然生物酶活性得不到發(fā)揮的原因之一。本研究重組的酶在高鹽環(huán)境下的高活性驗(yàn)證了以上猜測(cè)的合理性，同時(shí)對(duì)其他生物酶的改造也具有一定借鑒意義。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造的方式，獲得了源于海洋微生物溶珊瑚弧菌的幾丁質(zhì)酶，相比商品幾丁質(zhì)酶，酶活顯著提高，尤其在高鹽濃度下。增加幾丁質(zhì)結(jié)合保守域是近年來(lái)幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)改造的主要思路，本研究在保留了弧菌N 端幾丁質(zhì)酶的同時(shí)，在C 端增加陸生真菌幾丁質(zhì)結(jié)合保守域，進(jìn)一步增加酶與底物的普遍結(jié)合能力。溶珊瑚弧菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間海洋高鹽環(huán)境選擇，與其寄生生活史相關(guān)的致病基因都普遍適應(yīng)高鹽離子濃度，這與蛋白質(zhì)純化工藝中常用鹽離子濃度接近，選擇海洋微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶可大大減少蛋白質(zhì)工程中的脫鹽工藝步驟，節(jié)省純化成本。溶珊瑚弧菌雖然是近年珊瑚白化的病原物，但對(duì)其極端環(huán)境下寄生生活史深入研究有助于挖掘在其他應(yīng)用領(lǐng)域有價(jià)值的基因資源。