吳常偉，董 紅

（1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)口腔醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育缺陷性疾病是一類累及乳牙或恒牙，主要有兩大類：一類為牙本質(zhì)發(fā)育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI），另一類為牙本質(zhì)發(fā)育不良（dentinogenesis dysplasis，DD）。DGI 臨床上有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種表型，DD 有Ⅰ型和Ⅱ型兩種表型。DGI-Ⅰ與成骨不全相關(guān)的遺傳性牙本質(zhì)缺陷，DGI-Ⅱ、DGI-Ⅲ和DD-Ⅱ是獨(dú)立的遺傳性牙本質(zhì)缺陷[1-3]。最常見的是DGI-Ⅱ（OMIM 125490），患者乳牙、恒牙均受累，尤以乳牙更嚴(yán)重，牙本質(zhì)呈現(xiàn)特殊的乳白色使牙齒外觀為半透明乳光色，因此又稱為遺傳性乳光牙本質(zhì)（hereditary opalescent dentin），人群中的發(fā)病率為1/8000～1/6000，外顯率幾乎100%，具有高表達(dá)性和低頻率新生突變。組織學(xué)觀察：牙本質(zhì)小管稀疏、排列也不規(guī)則，牙本質(zhì)礦化程度明顯下降；沿釉質(zhì)生長線釉質(zhì)中斷處可發(fā)生牙釉質(zhì)斷裂[4-7]。目前研究認(rèn)為，牙本質(zhì)涎磷蛋白基因（dentin sialophosphoprotein，DSPP）是DGI-Ⅱ的致病基因。本研究針對牙本質(zhì)發(fā)育異常、臨床上確認(rèn)為遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅱ型的兩個(gè)獨(dú)立家系進(jìn)行DSPP 基因檢測分析，以進(jìn)一步闡明DSPP 基因突變與牙本質(zhì)發(fā)育異常之間的關(guān)系，擴(kuò)大牙本質(zhì)發(fā)育異常的DSPP 基因突變譜。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 兩個(gè)家系來自湖北省十堰市4 代21人，患者牙齒呈半透明淺藍(lán)色至棕黃色，釉質(zhì)剝脫，牙本質(zhì)較軟，牙冠磨損嚴(yán)重，X 線片顯示髓腔和根管狹窄或閉塞，乳牙、恒牙均受累。但無成骨發(fā)育不全癥狀和聽力喪失，確診為遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅱ型。征得患者和家屬同意采集兩個(gè)家系成員血樣，家系1 采集血樣8 份，其中患者3 份；家系2 采集血樣1 份，即先證者血樣。用一次性末梢采血針采血，F(xiàn)TA 洗脫卡（Whatman Cat No.WB120412）收集血樣，取100 μl 末梢血加入FTA 洗脫卡圓圈的中心位置，血樣自動向外擴(kuò)散，含樣本的位置由粉色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?0 ℃干燥30 min 后室溫保存，采樣時(shí)間2017 年10 月。

1.2 基因組DNA 提取 ①用直徑2 mm 的打孔器對FTA Elute 卡打孔獲取小圓片，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP 管；②向EP 管中加入500 μl 無菌水，混懸3 次，5 s/次，立即將EP 管中的水吸出；③使用無菌槍頭將EP 管中的小圓片轉(zhuǎn)移至0.5 ml EP 管中，加入30 μl 無菌水至0.5 ml EP 管；④將0.5 ml EP 管放至加熱器中98 ℃30 min；⑤混懸均勻后，將小圓片用槍頭挑出，EP 管中的溶液即為洗脫下來的基因組DNA。

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)合成 人類DSPP 基因序列從NCBI 網(wǎng)上獲?。℅enbank 序列號AF163151.2），引物設(shè)計(jì)覆蓋DSPP 基因的5 個(gè)外顯子及臨近區(qū)域。依據(jù)擴(kuò)增長度和測序要求，將DSPP 基因外顯子1、2各一個(gè)片段，外顯子3、4 一個(gè)片段，外顯子5 分成中間重疊的4 個(gè)片段。引物由北京新時(shí)代科技有限公司合成，PAGE 純化，使用前加雙蒸水至引物濃度為10 μmol/L，見表1。

表1 DSPP 基因編碼區(qū)引物序列

1.4 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為50 μl，上、下游引物各1 μl，基因組DNA 0.8 μl，2×Taq plus PCR MasterMix（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）25 μl，ddH2O 補(bǔ)充至50 μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)闉?4 ℃預(yù)變性5 min，然后按94 ℃40 s，56 ℃～58 ℃50 s，72 ℃2 min，循環(huán)35 次，在72 ℃8 min。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與回收 反應(yīng)結(jié)束取6 μl PCR 產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段。切膠回收PCR 產(chǎn)物的片段用天根生化科技（北京）有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析 測序工作由由北京新時(shí)代科技有限公司完成，測序結(jié)果均經(jīng)雙向測序證實(shí)。用Chromas 軟件查看測序結(jié)果，DNA 和蛋白質(zhì)序列比對用BLAST 軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 兩個(gè)DGI-Ⅱ家系9 個(gè)樣本的DSPP 基因編碼區(qū)除外顯子5 中的高度重復(fù)序列（Exon5-3）外的6 個(gè)片段均成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與其大小一致。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析 兩個(gè)家系DSPP 基因編碼區(qū)的擴(kuò)增片段中存在3 個(gè)堿基替換：外顯子4 的c.847G＞A（p.D243N）、c.1017A＞G（p.S299S）和外顯子5 的c.2091C＞T（p.G657G）。外顯子4 的c.847G＞A（p.D243N）的情況在患者和未患病的家庭成員中都存在，沒產(chǎn)生遺傳學(xué)效應(yīng)屬于中性突變，外顯子4 的c.1017A＞G（p.S299S）和外顯子5 的c.2091C＞T（p.G657G）屬于同義突變，見圖1～圖3。

圖1 外顯子4 的第243 密碼子G>A 的置換

圖2 外顯子4 的第299 密碼子A>G 的置換

圖3 外顯子5 的第657 密碼子C>T 的置換

3 討論

DGI-Ⅱ是一種常染色體顯性遺傳病，其致病基因DSPP 位于4q22.1，結(jié)構(gòu)基因DNA 序列全長9944 bp，由5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子組成[8，9]，DSPP基因編碼1301 個(gè)氨基酸的DSPP 蛋白，是牙本質(zhì)中主要的非膠原蛋白，DSPP 基因的表達(dá)具有組織特異性，主要在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，也在其他器官也有不同程度的表達(dá)。DSPP 蛋白經(jīng)切割產(chǎn)生大小不同、功能各異的兩個(gè)片段：牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）和牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP），其中外顯子2-4 編碼DSP 的N 端，外顯子5 編碼DSP 的C 端和DPP[10，11]。DSP 蛋白是一種糖基化蛋白，大部分糖基是涎酸，因此被命名為牙本質(zhì)涎蛋白，在牙本質(zhì)基質(zhì)中DSP 占牙本質(zhì)非膠原蛋白總量的5%～8%，在牙本質(zhì)發(fā)育的礦化過程中作用很小。DPP 牙本質(zhì)基質(zhì)中主要的非膠原蛋白，約占牙本質(zhì)非膠原蛋白總量的50%。DPP 的重要特征是富含絲氨酸和天冬氨酸,是體內(nèi)酸性很強(qiáng)的蛋白，而且多數(shù)絲氨酸磷酸化，組成大量次數(shù)不同的DSS、DS 的重復(fù)序列，高含量的天冬氨酸和磷酸絲氨酸使DPP 蛋白帶有大量的陰離子，并與鈣離子有高強(qiáng)度的親和力。DPP 蛋白對牙本質(zhì)形成和礦化起主要作用：與Ⅰ型膠原纖維結(jié)合集中于礦化前沿控制羥基磷灰石晶體的起始，在礦化過程中與其他蛋白結(jié)合在羥基磷灰石結(jié)晶表面控制晶體的形狀和大小[12，13]。目前在不同人群中發(fā)現(xiàn)DSPP 基因的40多個(gè)致病基因突變中位于DSP 編碼區(qū)多數(shù)為錯義突變或無義突變[14，15]；位于DPP 編碼區(qū)的多為移碼突變[16-19]。根據(jù)上述突變可以大致推測，DSP 編碼區(qū)的堿基突變可能干擾DSPP 蛋白的運(yùn)輸與加工，最終影響牙本質(zhì)的形成；DPP 編碼區(qū)的移碼突變可能破壞牙本質(zhì)成熟的整個(gè)過程。

本研究中，兩個(gè)DGI-Ⅱ家系DSPP 基因測序結(jié)果顯示突變均位于DSP 編碼區(qū)：外顯子4中c.847G＞A（p.D243N），該突變在DGI-II 家系正常成員和患者中均存在，即氨基酸的改變并不影響DSPP 蛋白的功能，屬于中性突變；外顯子4：c.1017A ＞G（p.S299S）和外顯子5：c.2091 C ＞T（p.G657G）屬于同義突變。因此，以上3 個(gè)堿基替換均表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。

人類基因組計(jì)劃雖然順利完成，但發(fā)現(xiàn)仍存在大量的未解之謎。隨著基因突變產(chǎn)生多種多樣的遺傳變異不斷引入人類基因庫，導(dǎo)致遺傳多態(tài)性。人類基因組中常見的遺傳多樣性有SNP、插入缺失多態(tài)性、拷貝數(shù)多態(tài)性和倒位多態(tài)性等[20-22]。其中SNP數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定，作為第三代的SNP 遺傳標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用廣泛。利用SNP 遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳學(xué)研究，如不同人種的眼睛虹膜顏色差異是由相關(guān)基因中的SNP 所決定；利用SNP 遺傳標(biāo)記也進(jìn)行疾病與基因關(guān)聯(lián)的醫(yī)學(xué)研究，致病基因定位、克隆與鑒定、疾病的基因診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療[23]；此外SNP 遺傳標(biāo)記普遍用于司法的親子鑒定。上述外顯子4 中c.847G＞A（p.D243N）突變是一個(gè)突變熱點(diǎn)，可作為SNP 遺傳標(biāo)記[6]。

相較常規(guī)的核酸提取方法，Whatman FTA 卡的最大優(yōu)勢就在于集樣本采集、保存、運(yùn)輸及核酸下游處理于一體。FTA 卡分為洗脫卡和非洗脫卡，基于不同的需求應(yīng)用和下游處理方法選擇具有特定功能的FTA 卡。本研究使用FTA 洗脫卡，血樣加入濾膜上被裂解，蛋白質(zhì)被結(jié)合在纖維基質(zhì)上，室溫干燥條件可以長時(shí)間保存，而DNA 直接被洗脫以溶液形式保存。相較于常規(guī)的DNA 提取技術(shù)，此方法提取DNA 快速、簡便、高效，利用FTA 卡進(jìn)行樣本采集和核酸洗脫不失為可推薦的常規(guī)核酸提取替代方法。

綜上所述，對兩個(gè)DGI-Ⅱ家系的DSPP 基因檢測所發(fā)現(xiàn)的三個(gè)堿基置換均表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性,該研究為DGI-Ⅱ致病基因克隆鑒定、實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)療奠定基礎(chǔ)。雖然DSPP 基因突變檢測技術(shù)成熟，但特定突變與臨床癥狀的相關(guān)性和具體機(jī)制仍不明確，DSPP 基因中的高度重復(fù)序列區(qū)域或者基因以外區(qū)域是否存在符合DGI-Ⅱ表型的基因突變有待進(jìn)一步研究。