李澤艷，王曉旋，來(lái)明名，馬雪艷

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤（low-grade glioma）是一組原發(fā)性腦腫瘤，起源于支持性膠質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)，并將Ⅱ和Ⅲ級(jí)統(tǒng)稱為低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤（LGG）[1,2]。早期研究表明[3]，LGG 在病理學(xué)、分子特征和預(yù)后等方面具有高度個(gè)體特異性。低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤最常見于35～44 歲的年輕人，生長(zhǎng)較為緩慢。然而，大多數(shù)低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤最終轉(zhuǎn)化為高級(jí)別膠質(zhì)瘤，導(dǎo)致預(yù)后較差[4]。因此，篩選敏感、可靠的生物標(biāo)志物對(duì)LGG 的早期診斷和預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。人類白細(xì)胞抗原Ⅱ類（human leukocyte antigen class Ⅱ，HLA-Ⅱ）分子主要與免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)，除了參與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)外，還廣泛參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程，包括增殖、成熟、凋亡、以及細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等生成過(guò)程[5，6]。此外據(jù)報(bào)道[7-9]，HLA-Ⅱ類分子常高表達(dá)于腫瘤中，主要與腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視形成腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)相關(guān)。主要組織相容性抗原復(fù)合體ⅡDMα（majorhistocompatibility complex class II-DM alpha，HLA-DMA）屬于人類白細(xì)胞抗原（HLA）非經(jīng)典Ⅱ類區(qū)，主要在抗原呈遞細(xì)胞（APC：B 淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）中表達(dá)，和其他HLA-Ⅱ類分子共同參與抗原的加工、提呈及其他免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。因此猜測(cè)，HLA-DMA 可能和其他HLA-Ⅱ類分子一樣，高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中并和其他HLA -Ⅱ分子共同參與腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，形成腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)。早期有研究表明HLADMA 多態(tài)性與腦膠質(zhì)瘤遺傳易感性有關(guān)[10]。但目前關(guān)于HLA-DMA 在LGG 中的表達(dá)及功能尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究將通過(guò)生物信息學(xué)方法分析HLA-DMA 在LGG 中的表達(dá)，探討HLA-DMA 在LGG 中的預(yù)后價(jià)值，以及HLA-DMA 與共表達(dá)基因在LGG 中的生物學(xué)作用。進(jìn)一步研究HLA-DMA 調(diào)控LGG 的可能機(jī)制，為L(zhǎng)GG 的診斷、治療和預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 數(shù)據(jù)來(lái)源于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn），癌基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/），基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（GeneCo -expreesionNetwork，Coexpedia）數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.coexpedia.org/）和FunRich 3.1.3 軟件。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)是由北京大學(xué)張澤民教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，收錄TCGA 和GTEx 項(xiàng)目的9736 例腫瘤和8587 例正常樣本的RNA 測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。可在線分析基因在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況以及正常組織與腫瘤組織mRNA 的表達(dá)情況。本次通過(guò)基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA）對(duì)HLA-DMA 在各種類型腫瘤中的表達(dá)情況進(jìn)行可視化并對(duì)HLA-DMA 在正常組織與LGG組織mRNA 的表達(dá)情況進(jìn)行在線分析。

1.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù) TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)定數(shù)據(jù)過(guò)濾條件如下：“brain”“TCGA-LGG”“transcriptome profiling”“Gene Expression Quantification”及“HTSeq-FPKM”，下載LGG RNA-seq 數(shù)據(jù)及LGG 患者臨床資料數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)。應(yīng)用perl 將下載文件中探針名字轉(zhuǎn)換為基因名字，使用R 軟件讀取轉(zhuǎn)換后文件，通過(guò)“l(fā)imma”包提取“HLA-DMA”表達(dá)數(shù)據(jù)。去除數(shù)據(jù)集中臨床病理參數(shù)不完整及缺乏預(yù)后隨訪資料的樣本，僅保留同時(shí)包含臨床參數(shù)和生存數(shù)據(jù)的樣本，共納入510 例患者進(jìn)行分析。

1.3.1 HLA-DMA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 應(yīng)用R（v3.5.3）軟件讀取TCGA-LGG 基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料數(shù)據(jù)，進(jìn)行Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，分析HLADMA 表達(dá)與腫瘤分級(jí)和年齡之間的關(guān)系。

1.3.2 HLA-DMA 與LGG 患者生存預(yù)后的相關(guān)性采用R（v3.5.3）軟件讀取TCGA-LGG 基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料數(shù)據(jù)，利用“survival”包根據(jù)HLA-DMA在LGG 中表達(dá)的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析兩者的總體生存情況。同時(shí)運(yùn)用“survminer”包繪制生存曲線，隨后對(duì)患者年齡、WHO 分級(jí)及HLA-DMA 表達(dá)水平進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析，預(yù)測(cè)影響LGG 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.4 Coexpedia 數(shù)據(jù)庫(kù) 利用Coexpedia 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析HLA-DMA 基因在LGG 中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并獲取共表達(dá)基因。按照Score＞2 對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行預(yù)處理，共篩選出20 個(gè)共表達(dá)基因。

1.5 FunRich 3.1.3.軟件 利用FunRich 3.1.3.軟件對(duì)HLA-DMA 與Coexpedia 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的20 個(gè)共表達(dá)基因的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、信號(hào)通路（biological pathway，BPA）進(jìn)行分析，臨界值設(shè)定P＜0.05。

1.6 GSEA 軟件 利用GSEA3.0 軟件分析HLA-DMA表達(dá)水平對(duì)各種生物通路基因集的作用。以HLADMA 高、低表達(dá)分組作為表型文件，按照GSEA 軟件默認(rèn)參數(shù)，隨機(jī)組合1000 次進(jìn)行富集分析。按錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）進(jìn)行序排序，并將FDR＜0.25 的基因集作為顯著富集基因集。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 下載數(shù)據(jù)集后使用R（v3.5.3）軟件進(jìn)行整理分析。HLA-DMA 在正常組織和LGG 組織中的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)；臨床病理特征采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；Log-rank 檢驗(yàn)計(jì)算基因表達(dá)與LGG 患者生存的關(guān)系；單因素和多因素Cox 回歸模型用于分析HLA-DMA 在LGG 患者中的預(yù)后意義。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-DMA 在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況 通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析HLA-DMA 在不同腫瘤中的表達(dá)情況，并進(jìn)行可視化分析。HLA-DMA 在彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBC）、膽管癌（Cholangiocarcinoma，CHOL）、胰腺癌（Pancreatic adenocarcioma，PAAD）、多形性膠質(zhì)瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）、急性髓細(xì)胞樣白血病（Acute Myeloid LeukemiaL，AML）、低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤（Low-Grade Glioma，LGG）、睪丸癌（Testicular Germ Cell Tumors，TGC）等多種腫瘤中高表達(dá)，見圖1。

圖1 HLA-DMA 在各種腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)

2.2 HLA-DMA 在低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中mRNA 的表達(dá)情況 使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織（518 例）和正常組織（207 例）中HLADMA 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行分析，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中HLA-DMA 的表達(dá)高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 HLA-DMA 在低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中mRNA 的表達(dá)情況

2.3 HLA-DMA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 TCGA數(shù)據(jù)集中共納入510 例臨床病理參數(shù)完整的病例資料，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析病例資料發(fā)現(xiàn)，WHO Ⅲ級(jí)的LGG中HLA-DMAmRNA 表達(dá)高于WHOⅡ級(jí)的LGG，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A，HLA-DMA的表達(dá)與LGG 患者的腫瘤分級(jí)相關(guān)。另外，不同年齡患者的HLA-DMA 的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3B。

圖3 HLA-DMA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HLA-DMA 與LGG 患者生存預(yù)后的相關(guān)性 使用R 軟件的“survival”軟件包進(jìn)行生存分析，采用“survminer”軟件包繪制生存曲線?？芍?，HLA-DMA表達(dá)量與低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者的總體生存率相關(guān)（P＜0.05），高表達(dá)HLA-DMA 患者的總體生存率低于低表達(dá)組，見圖4。HLA-DMA 高表達(dá)組的低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者5 年生存率為57.7%，而低表達(dá)組為70.1%。進(jìn)一步對(duì)影響LGG 患者預(yù)后的因素進(jìn)行單因素和多因素Cox 分析，單因素Cox 分析結(jié)果顯示，患者年齡、腫瘤分級(jí)、和HLA-DMA 表達(dá)水平均可能影響LGG 患者的預(yù)后。并將上述臨床指標(biāo)納入多因素回歸分析，結(jié)果顯示，患者年齡、腫瘤分級(jí)、HLA-DMA 高表達(dá)是影響LGG 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表1。

表1 LGG 預(yù)后影響因素的單因素、多因素Cox 回歸分析

圖4 HLA-DMA 與LGG 患者生存預(yù)后的相關(guān)性

2.5 HLA-DMA 與共表達(dá)基因在LGG 中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用Coexpedia 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制HLA-DMA 與共表達(dá)基因在LGG 中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，得到HLA-DMA 的共表達(dá)基因數(shù)為58 個(gè)，見圖5。其中score＞2 的共表達(dá)基因有20 個(gè)：CD74、HLA-DPB1、HLA -DRA、TYROBP、ITGB2、HCLS1、HLA -DQB1、LAIR1、LAPTM5、C1QB、HLA -DMB、FCER1G、MYO1F、C1QA、HLA-DPA1、CD86、CD53、LY86、MS4A6A、RNASET2。

圖5 HLA-DMA 在LGG 中共表達(dá)基因的分子網(wǎng)絡(luò)

2.6 HLA-DMA 及其共表達(dá)基因的注釋與分析 為了解HLA-DMA 與共表達(dá)基因在LGG 中的生物學(xué)功能，采用Funrich 軟件進(jìn)行基因注釋分析。結(jié)果顯示，分子功能方面，在MHC Ⅰ類受體活性、MHC Ⅱ類受體活性、受體活性、補(bǔ)體活性、T 細(xì)胞受體活性中起著重要作用，見表2 。生物學(xué)過(guò)程方面，12 個(gè)基因在免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，基因占比57.1%（P＜0.05），見表3。信號(hào)通路方面，主要參與免疫系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、STAT4 介導(dǎo)的IL12 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白（SIRP）家族的相互作用、CXCR4 介導(dǎo)信號(hào)信號(hào)傳遞等多條信號(hào)通路，見表4。

表2 HLA-DMA 共表達(dá)基因的分子功能

表3 HLA-DMA 共表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程

表4 HLA-DMA 共表達(dá)基因的信號(hào)通路

2.7 GSEA 分析HLA-DMA 相關(guān)富集基因集 為了進(jìn)一步研究HLA-DMA 參與腫瘤調(diào)控的機(jī)制，利用TCGA 的GSEA 數(shù)據(jù)集分析HLA-DMA 高表達(dá)組所參與的信號(hào)通路。結(jié)果表明，LGG 中HLA-DMA 高表達(dá)組主要富集于JAK-STAT 信號(hào)通路、細(xì)胞外基（ECM）受體相互作用、NOD 樣受體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、細(xì)胞凋亡、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、TOLL 樣受體、蛋白酶體等信號(hào)通路，見圖6。

圖6 GSEA 分析HLA-DMA 相關(guān)富集基因集

3 討論

低級(jí)別膠質(zhì)瘤是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）產(chǎn)生的一組異質(zhì)性腫瘤，患病人群一般為年輕人，但與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者相比，其病程更為緩慢，對(duì)患者的生活質(zhì)量影響甚微，所以一般不會(huì)對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性的治療[11-13]。近期有研究表明[14]，LGG 是一種原發(fā)性腦腫瘤，由于其具有浸潤(rùn)性，不能通過(guò)切除、化療、放療等方法完全根除，經(jīng)常演變?yōu)楦呒?jí)別的惡性腫瘤。因此篩選敏感、可靠的生物標(biāo)志物對(duì)LGG 的早期診斷和預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。

本研究基于生物信息學(xué)方法分析了HLA-DMA在LGG 中的表達(dá)及功能。首先，本研究通過(guò)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析HLA-DMA 在各種類型腫瘤組織中的表達(dá)差異，結(jié)果表明HLA-DMA 在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、膽管癌、胰腺癌、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、急性髓細(xì)胞樣白血病、低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤、睪丸癌等腫瘤組織中高表達(dá)。其次，本研究應(yīng)用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HLA-DMA 的表達(dá)量與臨床病理特征、生存預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示與Ⅱ級(jí)腫瘤相比，Ⅲ級(jí)腫瘤中HLA-DMA 表達(dá)上調(diào)。并且，高表達(dá)HLA-DMA的LGG 患者生存期低于低表達(dá)組。此外，單因素和多因素Cox 分析結(jié)果也表明HLA-DMA 的表達(dá)可作為L(zhǎng)GG 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果提示HLA-DMA 可能在LGG 發(fā)病過(guò)程中作為腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮作用，同時(shí)可以作為預(yù)后指標(biāo)預(yù)測(cè)LGG 患者的生存。

HLA-DMA 位于人類白細(xì)胞抗原非經(jīng)典Ⅱ類區(qū)，常與各類自身免疫性疾病相關(guān)。有大量文獻(xiàn)表明HLA 類分子通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫等免疫功能，清除腫瘤細(xì)胞[6]。本研究在GSEA 基因通路富集分析中發(fā)現(xiàn)除細(xì)胞凋亡信號(hào)通路外，B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、NOD 樣受體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、TOLL 樣受體信號(hào)等與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路也富集于高表達(dá)HLA-DMA 表型中。此外，對(duì)HLA-DMA 基因及其共表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和信號(hào)通路進(jìn)行分析表明，HLA-DMA 與共表達(dá)基因主要參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程。以上結(jié)果提示，調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路可能是HLA-DMA 促進(jìn)LGG 進(jìn)展的重要機(jī)制之一。但HLA-DMA 在免疫調(diào)控中的具體作用，以及是否能夠作為L(zhǎng)GG 治療靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

“凋亡”是指細(xì)胞程序性死亡[15，16]。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，凋亡通路通常會(huì)受到抑制，使腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)[17]。所以凋亡通路中的靶向蛋白通過(guò)上調(diào)促凋亡因子來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡可能是治療腫瘤的一個(gè)較為前景的方向[18]。早期研究報(bào)道，在腦膠質(zhì)瘤中，細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致治療效果不理想，因此凋亡抑制也是腦膠質(zhì)瘤治療不理想的原因之[19，20]。本研究通過(guò)GSEA 基因通路富集分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡通路在高表達(dá)HLA-DMA 表型中顯著富集，提示HLA-DMA 可能還通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑來(lái)調(diào)控LGG 的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，HLA-DMA 高表達(dá)與LGG 惡性進(jìn)展密切相關(guān)，可能是一個(gè)可預(yù)測(cè)LGG 預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。同時(shí)，HLA-DMA 可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫，并參與細(xì)胞凋亡相關(guān)通路影響LGG 的發(fā)生、發(fā)展。