許月嬌

(鄭州二砂醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

糖尿病作為臨床高發(fā)病種，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)發(fā)病人群最多，主要以慢性高血糖為特征，患者可出現(xiàn)胰腺β細(xì)胞功能障礙和外周組織胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。2011年，有研究者在“Nature”發(fā)表文章，證實(shí)T2DM是一種以胰島素抵抗為主要特征的慢性炎癥性疾病，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)對(duì)T2DM患者糖代謝紊亂具有重要意義[2]。炎癥因子對(duì)細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有抑制作用，抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，使血清中葡萄糖含量升高，引發(fā)胰島素抵抗[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病治療主要通過(guò)口服降糖藥物配合胰島素注射，但長(zhǎng)期使用西藥會(huì)出現(xiàn)高胰島素血癥、藥物易失效等問(wèn)題[4]。近年來(lái)，眾多研究者通過(guò)中藥、中藥單體、中藥復(fù)方研究展開(kāi)糖尿病實(shí)驗(yàn)研究，取得不錯(cuò)的成就。中醫(yī)藥注重整體觀念，辨證施治的思維，全面把控疾病，且不良反應(yīng)較輕，這對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療具有西醫(yī)不可取代的優(yōu)勢(shì)[5]。中藥香青蘭(Dracocephalum Moldavica L.)隸屬唇形科植物，具利尿止咳、補(bǔ)益心腦、活血化痰、止痛解毒之功，目前臨床主要用于冠心病、動(dòng)脈硬化、高血壓、心肌缺血、心絞痛等疾病的治療，化學(xué)成分較多，主要包括甾體類與三萜類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)類、黃酮類、苯丙素類等成分[6-7]。香青蘭中黃酮類化合物近年來(lái)因作用廣泛被眾多研究者關(guān)注?？敌↓埖萚8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮可抑制哮喘CRP、LTB4、LTC4、TNF-α、IL-6、IL-13和IL-17等炎癥因子的釋放，在抗炎方面具有顯著藥效。本次研究通過(guò)建立T2DM模型，基于炎癥反應(yīng)觀察香青蘭總黃酮對(duì)T2DM大鼠胰島功能影響及作用機(jī)制研究，為香青蘭的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)捷)；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：H1650R，湖南湘儀)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：DY001292，蘇州吉諾瑞生物科技有限公司)；電子秤(型號(hào)：BT457A，深圳市博途電子科技有限公司)；生物顯微鏡(型號(hào)：S800T-T310，蘇州倍特嘉光電科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

香青蘭總黃酮(寶雞晨光生物科技有限公司，每100g香青蘭藥材含香青蘭總黃酮52.35g)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制，批號(hào)：20190622，規(guī)格：0.5g)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S0130，規(guī)格：100 mg)；檸檬酸鈉、檸檬酸(成都市恒億化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)分別為20190613、20190325)；胰島素(INS，批號(hào)：E20191023A)、胰島素抗體(IAA，批號(hào)：E20190915A)、腫瘤壞死因子(TNF-α，批號(hào)：E20190925A)、白介素-1β(IL-1β，批號(hào)：E20191017A)、白細(xì)胞介素-6(IL-6，批號(hào)：E20191005A)、白介素-18(IL-18，批號(hào)：E20191013A)、C-反應(yīng)蛋白(CRP，批號(hào)：E20191011A)、瘦素(LP，批號(hào)：E20191019A)、脂聯(lián)素(ADPN，批號(hào)：E20190928A)、高遷移率族蛋白1(HMGB1，批號(hào)：E20190907A)試劑盒均購(gòu)自蘇州卡爾文生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G112)。

1.3 動(dòng)物

動(dòng)物級(jí)別：SPF級(jí)；品系：SD大鼠；數(shù)量：75只；性別：雄性；周齡：7～8周齡；體質(zhì)量：220～240g，供應(yīng)單位：濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003。高脂高糖飼料(1.5%膽固醇、10%豬油、0.25%膽酸鈉、5%蔗糖、83.25%普通飼料，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司)。

1.4 方法

動(dòng)物置適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，飼養(yǎng)室溫度控制在25℃，濕度45%～75%。隨機(jī)選取12只為空白組，采用普通飼料正常飼養(yǎng)，剩余動(dòng)物采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，一次性舌下靜脈注射STZ 60mg/kg(注射劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)成模率進(jìn)行確定)，7d后血糖儀測(cè)定造模動(dòng)物空腹動(dòng)態(tài)血糖值，取血糖值在16.7～24.00mmol/L范圍內(nèi)且具有明顯多飲、多食、多尿癥狀大鼠52只為成模動(dòng)物，隨機(jī)分為模型組、鹽酸二甲雙胍組、香青蘭總黃酮高劑量組、香青蘭總黃酮低劑量組，每組12只(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，低劑量組及鹽酸二甲雙胍組均死亡1只，為保證結(jié)果平行，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每組10只進(jìn)行檢測(cè)統(tǒng)計(jì))，各組動(dòng)物分別給予相應(yīng)藥物灌胃，鹽酸二甲雙胍組(167mg/kg)，香青蘭總黃酮高劑量組(200mg/kg)，香青蘭總黃酮低劑量組(100mg/kg)給藥劑量參照文獻(xiàn)[9]，各組動(dòng)物給藥體積為2mL/100g，1次/d，連續(xù)給藥6周。為保證實(shí)驗(yàn)平行性，空白組和模型組需灌胃同等體積生理鹽水。

1.5 指標(biāo)監(jiān)測(cè)

1.5.1 動(dòng)態(tài)血糖檢測(cè)

分別于第2、4、6周檢測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖值。

1.5.2 血清指標(biāo)檢測(cè)

各組動(dòng)物末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈插管收集血清，3 500r/min，15min離心，檢測(cè)INS、IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、LP、ADPN、HMGB1含量。

1.5.3 病理指標(biāo)檢測(cè)

摘取胰腺置10%甲醛溶液中固定48h以上，脫水，石蠟包埋，切片(厚度4～6μm)，進(jìn)行HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組動(dòng)物胰腺病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組空腹動(dòng)態(tài)血糖值比較

與空白組比較，模型組動(dòng)物空腹血糖值自建模后至第6周均異常升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組自建模第2周起空腹血糖值均呈現(xiàn)不同程度降低趨勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，香青蘭總黃酮低劑量組自建模第4周起動(dòng)態(tài)血糖值不同程度降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)T2DM大鼠模型空腹動(dòng)態(tài)血糖值影響

2.2 各組大鼠血清INS、IAA含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清INS含量顯著降低，IAA含量顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組均可顯著提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組也可明顯提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)T2DM大鼠模型血清INS、IAA含量影響

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量也不同程度降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)T2DM模型大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量影響

2.4 大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中LP、HMGB1含量顯著升高，ADPN含量顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組可顯著降低模型動(dòng)物血清中LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組也可不同程度降低動(dòng)物血清LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)T2DM模型大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量影響

2.5 大鼠胰腺組織影響

空白組胰島邊界清晰，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核松散，胰島細(xì)胞漿豐富；模型組胰島皺縮，邊界不清，細(xì)胞排列稍紊亂，胰島細(xì)胞漿不豐富；鹽酸二甲雙胍組胰島邊界清晰，偶見(jiàn)界欠清胰島，偶見(jiàn)胰島中有空泡，胰島細(xì)胞漿較豐富；香青蘭總黃酮高劑量組胰島細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞排列緊密，偶見(jiàn)胰島中有空泡，胰島胞漿較豐富；香青蘭總黃酮低劑量組胰島細(xì)胞邊界欠清晰，胰島中有空泡，胞漿稍欠豐富。各組大鼠胰腺組織鏡下觀察見(jiàn)圖1～5(封二)。

3 討 論

本次研究是基于炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)上對(duì)T2DM模型進(jìn)行藥效學(xué)研究，通過(guò)模型組血糖水平及血清胰島素水平可知模型復(fù)制成功。臨床研究顯示，T2DM患者多伴隨機(jī)體內(nèi)部炎癥反應(yīng)高于正常值，相關(guān)炎癥指標(biāo)異常升高，TNF-α是機(jī)體主要的促炎細(xì)胞因子，參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。研究[10]顯示TNF-α可抑制葡萄糖載體4(GLUT4)及胰島素底物1(IRS1)的表達(dá)，抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，而使得IRS-1絲氨酸磷酸化增強(qiáng)，阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)功能。

CRP是一種極性反應(yīng)蛋白，由肝臟分泌，血清中CRP濃度與T2DM的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)性。目前，血清CRP已成為臨床最顯著炎癥標(biāo)志物之一，成為T2DM的重要預(yù)測(cè)因子。而IL-6、IL-1β及TNF的轉(zhuǎn)錄可調(diào)控CRP的表達(dá)。正常情況下，胰島素可抑制CRP釋放，當(dāng)機(jī)體呈現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，CRP被抑制作用逐漸減弱，導(dǎo)致體內(nèi)CRP水平升高，直接參與全身炎癥反應(yīng)，加劇IR及2型糖尿病的發(fā)展。IL-18作為一種促炎癥細(xì)胞因子，與糖尿病多種并發(fā)癥尤其是糖尿病腎病的發(fā)生密切相關(guān)，IL-18分泌的增加可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重?fù)p傷腎小球，促進(jìn)前列腺素釋放，降低腎小球?yàn)V過(guò)作用，使蛋白漏出增多[10-11]。本研究顯示，模型動(dòng)物血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量均顯著高于空白組，經(jīng)香青蘭總黃酮干預(yù)后以上指標(biāo)均有不同程度降低，可知香青蘭總黃酮可有效降低T2DM大鼠血清中炎癥因子水平，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生。

LP是一種特異性炎癥因子，由脂肪組織分泌，與胰島素的產(chǎn)生有著極大的關(guān)聯(lián)，在胰島素抵抗等病理情況下，瘦素增多則會(huì)造成脂肪組織胰島素抵抗，即脂肪合成減少，分解增加，產(chǎn)生大量的游離脂肪酸而引起胰島素抵抗[12]。ADPN是由脂肪細(xì)胞分泌的生物活性多肽，是胰島素的增敏劑，在低血糖狀態(tài)下可對(duì)胰島素的分泌產(chǎn)生抑制作用；相反，當(dāng)機(jī)體處于高血糖狀態(tài)時(shí)，可促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素，用于衡量胰島β細(xì)胞的功能[13]。本研究顯示，模型組動(dòng)物血清中LP含量升高，ADPN含量降低，經(jīng)香青蘭總黃酮干預(yù)后出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，LP含量降低，ADPN含量升高。

HMGB1屬于一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白，在所有真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有分布，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程，在多種疾病的新生血管生成和組織細(xì)胞凋亡中起到重要作用，而HMGB1也是新近發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)[14]。HMGB1可調(diào)控晚期糖基化終產(chǎn)物受體和Toll樣受體2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使NF-κB表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α合成、分泌，誘發(fā)和放大炎癥反應(yīng)，加重糖尿病病情[15]。本次研究發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物血清中HMGB1含量明顯升高，經(jīng)過(guò)香青蘭總黃酮各劑量組干預(yù)后血清含量明顯降低，可推知，香青蘭總黃酮的抗炎作用可能對(duì)HMGB1蛋白具有一定干預(yù)作用，從而降低糖尿病炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，香青蘭總黃酮可有效降低T2DM模型動(dòng)物血清中空腹動(dòng)態(tài)血糖值，降低血清中IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、HMGB1、LP水平，升高血清中INS、ADPN含量，修復(fù)受損胰腺，有效控制糖尿病病情。相關(guān)作用機(jī)制可能與調(diào)控機(jī)體HMGB1蛋白有關(guān)，阻斷炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生。但確切作用機(jī)制需進(jìn)一步深入探討，明確香青蘭總黃酮具體作用位點(diǎn)。