徐 瑩，周 茹，秦華章，張欣洲，馬華林**

(1.深圳市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 深圳 518020;2.深圳市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科/深圳市腎臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒癥常見的并發(fā)癥之一，膿毒癥若并發(fā)AKI將明顯加重膿毒癥病情以及增加患者病死率[1-2]。有研究表明[3]，腎小管上皮細(xì)胞急性損傷是膿毒癥致AKI重要的病理生理機(jī)制。眾多研究表明[4-6]，膿毒癥誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與促炎與抗炎的激活及后續(xù)的效應(yīng)，包括細(xì)胞和體液免疫，接著產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，其中包括IL-1、TNF-α和IL-6，并發(fā)展成為細(xì)胞因子風(fēng)暴。我們課題組前期的研究結(jié)果表明[7]，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HuMSCs)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠AKI模型可起到有效保護(hù)作用。本研究擬觀察HuMSCs及其來(lái)源外泌體對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(human kidney-2，HK-2)LPS毒性的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及材料

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(human kidney-2，HK-2)，購(gòu)自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)干細(xì)胞庫(kù)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)HuMSCs均由深圳市人民醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心實(shí)驗(yàn)室分離、擴(kuò)增培養(yǎng)以及保存。實(shí)驗(yàn)中使用的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表型特征符合MSC表型；微生物檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，mock組不做任何處理；其余組在加入LPS(1μg/mL)處理24h后，co-cul組采用共培養(yǎng)方式，將鋪滿已用TNFα預(yù)處理24h的人臍帶MSC細(xì)胞的上室放入共培養(yǎng)體系(HK-2細(xì)胞在下室)，其余各組更換新的培養(yǎng)基，HK-2細(xì)胞+LPS+人臍帶MSC細(xì)胞-Ex分別加入不同濃度的人臍帶MSC細(xì)胞來(lái)源的exosomes繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集各組的HK-2細(xì)胞及上清液備用(MTS、凋亡預(yù)實(shí)驗(yàn)確定LPS誘導(dǎo)損傷濃度效果)，每組7個(gè)復(fù)孔。

mock組：HK-2細(xì)胞

0μg/mL組：HK-2細(xì)胞+LPS

co-cul組：HK-2細(xì)胞+LPS+人臍帶MSC細(xì)胞(TNFα預(yù)處理后的細(xì)胞)

25μg/mL組：HK-2細(xì)胞+LPS+25μg/mL人臍帶MSC細(xì)胞-Ex

50μg/mL組：HK-2細(xì)胞+LPS+50μg/mL人臍帶MSC細(xì)胞-Ex

75μg/mL組：HK-2細(xì)胞+LPS+75μg/mL人臍帶MSC細(xì)胞-Ex

100μg/mL組：HK-2細(xì)胞+LPS+100μg/mL人臍帶MSC細(xì)胞-Ex

1.2.2 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖變化

細(xì)胞活力的MTS法檢測(cè)HK-2細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，將20μL檢測(cè)液加入培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后使用酶標(biāo)儀上檢測(cè)490nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。

1.3 方法

1.3.1 外泌體分離提取

根據(jù)試劑說(shuō)明書，使用ExoQuick試劑沉淀試劑盒(System Biosciences，SBI，Mountain View，CA)通過聚合物配制方法從血清中分離外泌體。分離后立即將所有外泌體儲(chǔ)存在-80°C備用。 使用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法(Bio-Rad，弗吉尼亞州，美國(guó))確定分離的外泌體總蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 HuMSC-ex的鑒定

(1)透射電鏡和納米顆粒示蹤技術(shù)(NTA)檢測(cè)HuMSC-ex。

取20μL HuMSC-ex滴加于銅網(wǎng)上，靜置5min，將殘余液體吸去后置于磷鎢酸(pH 6.8)液滴上行負(fù)染5min，然后采用透射電鏡觀察并拍照。取100μL HuMSC-ex，采用納米顆粒分析儀進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

(2)Western blot檢測(cè)HSPA8、Alix、CD63以及TSG101等標(biāo)記蛋白分子的表達(dá)。

HuMSC-ex與RIPA按1∶1混勻，置于冰上10min，震蕩1min，重復(fù)3次，然后離心15min取上清液，測(cè)得蛋白濃度后加入緩沖液，煮沸10min。配制SDS-PGAE，計(jì)算上樣量，加樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后在恒流濕轉(zhuǎn)2h，脫脂牛奶室溫封閉1h。HSPA8、Alix、CD63以及TSG101抗體稀釋后孵育過夜，洗膜后曝光。

1.3.3 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各組TLR4的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)采用Invitrogen設(shè)計(jì)并合成了特異性引物qRT-PCR，所有的qRT-PCR分析均通過Light-Cycler480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(羅氏)來(lái)執(zhí)行。免疫印跡(Western blot)法用Bio-Rad蛋白測(cè)定系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉堵塞1h，與初級(jí)抗體孵育一夜。膜與HRP標(biāo)記的次級(jí)抗體孵育室溫下1h，在TBST(三乙醇胺緩沖鹽水與吐溫)中洗滌3～10min。含有這些蛋白質(zhì)的膜用適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫印跡。

1.3.4 Elisa檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎癥介質(zhì)(IL-1、IL-6、TNF-α)的水平

按照試劑說(shuō)明做好準(zhǔn)備工作，配制好各種溶液。根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。分別將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100mL/孔)加入相應(yīng)孔中，空白孔加樣本/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100mL/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90min。洗板4次：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350uL，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。加入生物素化抗體工作液(100mL/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育60min。洗板4次。加入酶結(jié)合物工作液(100mL/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育30min。洗板4次。加入顯色劑90mL/孔，避光，37℃孵箱孵育25～30min。加入終止液100mL/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值(5min內(nèi))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)比較樣本均數(shù)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的分離和鑒定

大量培養(yǎng)人臍帶MSC細(xì)胞，經(jīng)濃度為10ng/mL TNF-α刺激48h后，收集上清液，分離exosomes。

(1)透射電鏡下觀察HuMSC-ex 的形態(tài)為圓形或者橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑約為 100nm左右，大小不均(圖1A)。

A.外泌體(圖中紅色箭頭)在透射電鏡下為橢圓形或者圓形囊泡狀；B.WB檢測(cè)exosomes標(biāo)志物CD63、TSG101、HSPA8及Alix；C.NTA結(jié)果

(2)WB檢測(cè)exosomes標(biāo)志物CD63、TSG101、HSPA8及Alix進(jìn)行鑒定；發(fā)現(xiàn)HuMSC-ex表達(dá)特異性標(biāo)記CD63、TSG101、HSPA8及Alix(圖1B)。

(3)采用納米顆粒示蹤(NTA)進(jìn)行exosomes大小鑒定；分離的外泌體中50%的直徑小于118.1nm，90%的直徑小于163.9nm，大小符合外泌體特征(圖1C)。

2.2 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖變化

MTS結(jié)果顯示：LPS刺激后，HK-2細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.05)；人臍帶MSC細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，HK-2細(xì)胞增殖水平明顯增加(P<0.05)，表明人臍帶MSC細(xì)胞外泌體同樣可以促進(jìn)HK-2細(xì)胞的增殖。見圖2。

與mock組相比，*P<0.05；與0μg/mL組相比，△P<0.05，n=8

2.3 qRT-PCR和WB檢測(cè)各組TLR4的表達(dá)

qRT-PCR和WB結(jié)果顯示：給予LPS刺激后，HK-2細(xì)胞TLR4的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，人臍帶MSC細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后可抑制TLR4的表達(dá)(P<0.05)，人臍帶MSC細(xì)胞外泌體同樣可以抑制TLR4的表達(dá)(P<0.05)，而且隨著外泌體的增加其抑制作用亦增強(qiáng)。見圖3。

A.qPCR檢測(cè)不同處理組TLR4 mRNA的表達(dá)(與mock組相比， *P<0.05；與0μg/mL組相比，△P<0.05，n=8)；B.WB檢測(cè)不同處理組TLR4蛋白的表達(dá)

2.4 Elisa檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎癥介質(zhì)(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平

LPS刺激后，HK-2細(xì)胞的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，人臍帶MSC細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)(P<0.05)，人臍帶MSC細(xì)胞外泌體亦可降低它們的表達(dá)(P<0.05)。見圖4。

A.各組IL-1β水平；B.各組IL-6水平；C.各組TNF-α水平(與mock組相比，*P<0.05；與0μg/mL組相比，△P<0.05，n=8)

3 討 論

AKI是膿毒癥最常見的并發(fā)癥也是增加其救治難度和病死率以及影響預(yù)后的重要原因[8]。近年有研究表明[3]，膿毒癥引起AKI的重要環(huán)節(jié)是LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，但其具體機(jī)制暫未明確。

HuMSCs是人體最重要的成體干細(xì)胞之一，其來(lái)源非常廣泛，增殖速度快，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及成骨細(xì)胞等[9]。目前有學(xué)者認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞協(xié)調(diào)腎臟保護(hù)的作用是通過分泌大量趨化因子和細(xì)胞因子并釋放諸如外泌體等活性物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并與其通過免疫調(diào)節(jié)、趨化、抗凋亡和血管生成等機(jī)制密切相關(guān)[10]。MSC釋放的外泌體選擇性地將含有mRNAs、microRNAs和蛋白質(zhì)等具有一定特異性的物質(zhì)參與蛋白水解、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡和血管生成等途徑[11-12]。有證據(jù)表明在體內(nèi)外MSC分泌的外泌體均具有與MSC相似的功能，均可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近端腎小管壞死、氧化應(yīng)激、凋亡和體內(nèi)大量管狀蛋白鑄型的形成，保護(hù)其腎功能[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)：LPS抑制HK-2細(xì)胞的增殖，TNFα刺激人臍帶MSC細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)，以及人臍帶MSC細(xì)胞外泌體可以修復(fù)LPS帶來(lái)的損傷。以上結(jié)果表明，HuMSC-ex的預(yù)處理可明顯降低LPS對(duì) HK-2 細(xì)胞的損傷作用。TLR4作為重要的受體家族成員，可以通過識(shí)別LPS主要受體參與炎癥反應(yīng)。通過阻斷TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后調(diào)節(jié)其炎癥免疫反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)，提高膿毒癥患者的生存率[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)HK-2細(xì)胞TLR4的表達(dá)，人臍帶MSC細(xì)胞外泌體亦可以抑制TLR4的表達(dá)。而且研究中發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)HK-2細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，TNFα刺激人臍帶MSC細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)，以及人臍帶MSC細(xì)胞外泌體會(huì)抑制LPS導(dǎo)致的炎癥因子表達(dá)升高。

綜上所述，在體外人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體均能顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖；抑制LPS導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞TLR4及炎癥因子表達(dá)。