許鳴超，侯鵬飛，張令巧

(濮陽市油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 濮陽 457001)

結(jié)腸癌是世界上第4大常見的癌癥，也是癌癥死亡的第3大原因[1]。盡管隨著結(jié)腸鏡的發(fā)展和普及，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降[2]。但是，每年結(jié)腸癌的死亡率和死亡人數(shù)仍然很高。因此，探究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，制定結(jié)腸癌的治療策略具有重要意義。

有研究表明miRNA可能作為癌基因或抑癌基因來調(diào)節(jié)增殖、遷移和侵襲過程中關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)進(jìn)而影響結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。miR-4711-5p通過KLF5、MDM2和TFDP1調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性和細(xì)胞周期[4]。miR-520f-3p作為miRNA的一種，在多種癌癥中異常表達(dá)。例如，膽管癌[5]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]和胃癌[7]等。但是miR-520f-3p影響結(jié)腸癌的作用機(jī)制仍不完善，需要進(jìn)一步探索。

轉(zhuǎn)錄因子SOX9(SRY-related high mobility group-box 9)屬于SOX蛋白家族，包括SOX8、SOX9、SOX10和SOXE[8]。許多研究表明SOX9對多種癌癥的發(fā)生發(fā)展都有影響，例如SOX9通過Wnt/β-catenin信號通路影響非小細(xì)胞肺癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]；miR-30c通過靶向SOX9阻礙膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移[10]。但是，關(guān)于SOX9在結(jié)腸癌細(xì)胞中的功能鮮有研究。

本次實(shí)驗(yàn)主要研究了miR-520f-3p和SOX9在結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)情況以及miR-520f-3p與SOX9基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及儀器

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM-460(BNCC339288)和人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116(BNCC337692)、SW480(BNCC100604)、HT-29(BNCC100164)均購自北納生物。

FBS(Gibco，Grand Island，NY，USA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Vilnius，Lithuania)、QuantiTect SYBR Green PCR Master mix(Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan)、BCA定量試劑盒(Thermo fisher，USA)、PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)、ECL試劑盒(Solarbio，Beijing，China)、兔抗SOX9(Abcam，UK)、兔抗β-actin(Abcam，UK)，山羊抗兔IgG(Abcam，UK)、CCK8溶液(Dojidon，Japan)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad，USA)、Transwell(BD Biosciences，CA，USA)、pmirGLO熒光素酶報告載體(Promega，WI，USA)、基因檢測試劑盒(Promega，F(xiàn)itchburg，WI，USA)、GraphPad Prism軟件(GraphPad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NCM-460和HT-29在McCoy’s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HCT 116在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SW480在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基均添加10%的FBS。所有細(xì)胞都在CO2濃度為5%、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-520f-3p模擬物miR-520f-3p mimics和對照模擬物NC mimics以及pcDNA3.1-SOX9載體oe-SOX9和空的pcDNA3.1質(zhì)粒載體oe-NC均由GenePharma公司(中國上海)合成。根據(jù)制造商說明書使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測(qRT-PCR)

謝清森通過主動申請聯(lián)系和多方努力，在2014年與英國聯(lián)合安保公司成功牽手，共同成立七兵堂國際安保集團(tuán)(中國)有限公司，這一跨越國界和意識形態(tài)的歐亞牽手，標(biāo)志著七兵堂正式開始涉足國際安保服務(wù)領(lǐng)域，歷史性地實(shí)現(xiàn)了走出國門、邁向世界的遠(yuǎn)大夢想。

采用TRIzol試劑從細(xì)胞提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用QuantiTect SYBR Green PCR Master mix進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。SOX9以GAPDH為內(nèi)參，miR-520f-3p以U6為內(nèi)參，引物序列如下：miR-520f-3p(forward)：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3'，(reverse)：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'；SOX9(forward)：5'-AGGAAGTCGGTGAAGAACGG-3'，(reverse)：5'-CGCCTTGAAGATGGCGTTG-3'；GAPDH(forward)：5'-TGACTTCAA CAGCGACACCCA-3'，(reverse)：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；U6(forward)：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3'；(reverse)：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3'。結(jié)果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實(shí)驗(yàn)組miR-520f-3p和SOX9 mRNA相對表達(dá)量的差異。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

使用全蛋白裂解液裂解細(xì)胞，BCA定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度。取樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳。然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2h。用一抗孵育一晚，二抗孵育1h。最后，用ECL試劑盒檢測蛋白印記并拍照。本研究所用的一抗為：兔抗SOX9、兔抗β-actin，二抗為：山羊抗兔IgG。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK8比色法檢測細(xì)胞增殖能力。將細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔平板。分別培養(yǎng)24h、48h和72h后，每組選取5個復(fù)孔，在孔中加入10μL CCK8溶液孵育1h。最后使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450nm波長下的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于12孔板(2×105個/孔)中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，采用200μL無菌槍頭人為的輕輕劃擦穿過孔中心的單層。然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞2次，并在無血清培養(yǎng)基中孵育。分別再培養(yǎng)24h后用顯微鏡觀察并拍攝愈合圖像。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在涂有基質(zhì)膠的Transwell上室中接種約2×104個細(xì)胞，在下室中加入600μL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后用4%甲醛溶液進(jìn)行固定，用0.1%的結(jié)晶紫染色。選取5個視野，通過顯微鏡觀察細(xì)胞的侵襲情況并拍照。

1.2.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建了插入SOX9野生型(wt)和突變型(mut)3' UTR的pmirGLO熒光素酶報告載體。將HCT 116細(xì)胞接種在48孔板中并培養(yǎng)24h，將miR-520f-3p mimics/NC-mimics和pmirGLO wt/mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，48h后收集細(xì)胞。然后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-520f-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM-460相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116、SW 480、HT-29中miR-520f-3p表達(dá)顯著下調(diào)(圖1)。

(與NCM-460相比，*P<0.05，n=3)

2.2 過表達(dá)miR-520f-3p抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組的miR-520f-3p表達(dá)量顯著高于對照組(圖2A，封三)，可以用于接下來的實(shí)驗(yàn)。隨后，CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-520f-3p的結(jié)腸癌細(xì)胞相較于對照組增殖能力明顯降低(圖2B，封三)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT 116細(xì)胞中，過表達(dá)miR-520f-3p顯著抑制了細(xì)胞的遷移(圖2C，封三)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-520f-3p mimic的HCT 116細(xì)胞侵襲能力低于對照組(圖2D，封三)。這些結(jié)果表明，過表達(dá)miR-520f-3p可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

2.3 miR-520f-3p靶向下調(diào)SOX9

qRT-PCR和Western blot檢測人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系和人結(jié)腸癌細(xì)胞系中SOX9 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示SOX9 mRNA和蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)(圖3A～3B)。Targetscan預(yù)測得到SOX9和miR-520f-3p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖3C)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-141-3p過表達(dá)會顯著降低SOX9-wt熒光素酶活性，而對SOX9-mut熒光酶素活性無明顯影響(圖3D)。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-520f-3p后，SOX9的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖3E～3F)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了miR-520f-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中靶向調(diào)控SOX9。

2.4 miR-520f-3p靶向下調(diào)SOX9抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示過表達(dá)處理SOX9后，SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)；而同時過表達(dá)miR-520f-3p后，SOX9的表達(dá)水平明顯下降(圖3A～B，封三)。CCK8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)SOX9表達(dá)上調(diào)時，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，然而，同時過表達(dá)miR-520f-3p后細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低(圖4C～E，封三)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了miR-520f-3p是通過調(diào)控SOX9抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3 討 論

結(jié)腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。盡管治療手段不斷發(fā)展，結(jié)腸癌的五年生存率仍不令人滿意[2]。因此，十分有必要探究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找更好的治療方法。在過去的研究中，miRNA被發(fā)現(xiàn)在許多類型的人類癌癥中調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，這可以作為治療靶標(biāo)[11]。對于結(jié)腸癌，人們發(fā)現(xiàn)miR-378通過抑制SDAD1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]；miR-219a-1通過靶向MEMO1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]，可見miRNA是結(jié)腸癌潛在生物標(biāo)志物的來源之一。目前為止，miR-520f已被發(fā)現(xiàn)在NSCLC中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，circ-0043278通過直接抑制miR-520f來增加ROCK1、CDKN1B和AKT3的表達(dá)，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14]；另外，miR-520f被發(fā)現(xiàn)在人HCC組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)。而且，miR-520f的表達(dá)異常與HCC患者的較大腫瘤、晚期TNM分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是，miR-520f-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)模式和作用仍然未知。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，相比于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，miR-520f-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞系中均顯著低表達(dá)，這與其在其它疾病中的結(jié)果一致。

在本研究中，通過構(gòu)建過表達(dá)miR-520f-3p的結(jié)腸癌細(xì)胞，以及細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-520f-3p可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-520f-3p是結(jié)腸癌進(jìn)展中的腫瘤抑制因子。與本研究結(jié)果一致，先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-520f抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]，下調(diào)miR-520f的表達(dá)水平會導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[16]。

已知miRNA通過靶mRNA3'-UTR結(jié)合來控制基因表達(dá)。為了評估m(xù)iR-520f-3p如何影響結(jié)腸癌，本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞系中鑒定其靶基因。以往有研究表明，miR-520f-3p在SOX9在結(jié)腸癌的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[17]。SOX9是一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子，它在調(diào)節(jié)軟骨形成、性腺和胰腺形成等多種發(fā)育途徑中發(fā)揮重要作用[18]。多種miRNA已顯示靶向SOX9，據(jù)報道，miRNA-105通過直接靶向SOX9抑制胃癌的進(jìn)展[19]；Sang等研究報道m(xù)iR-613在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中靶向SOX9抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]。本研究發(fā)現(xiàn)SOX9在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-520f-3p能夠調(diào)控SOX9的表達(dá)水平，并且雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩者之間的靶向關(guān)系。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-520f-3p能夠回復(fù)上調(diào)SOX9對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程的促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明，miR-520f-3p通過調(diào)控SOX9進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，調(diào)節(jié)miR-520f-3p/SOX9途徑的靶向療法可能會成為改善結(jié)腸癌患者生存率的新機(jī)會。

總而言之，本研究證明了在結(jié)腸癌中miR-520f-3p低表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用，上調(diào)miR-520f-3p能夠抑制SOX9的表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)功能；同時也揭示了miR-520f-3p在結(jié)腸癌惡性進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為miR-520f-3p作為結(jié)腸癌的靶向化療藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為靶向治療結(jié)腸癌提供新思路，從而促進(jìn)新型抗癌藥物的開發(fā)。